| 研究課題/領域番号 |
20H03180
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
伊藤 耕一 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (10262073)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2023年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2022年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2021年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2020年度: 5,850千円 (直接経費: 4,500千円、間接経費: 1,350千円)
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| キーワード | リボソーム / tRNA分子擬態タンパク質 / タンパク質合成 / 翻訳終結 / tRNA擬態タンパク質 / 品質管理 / 分子遺伝学 / キーワード / リボソーム再生 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
近年急速な機能・構造理解が進んだイメージがある遺伝暗号解読機構ではあるが、真核細胞においてのタンパク質合成終了反応からリボソーム再生反応が含まれる『翻訳終結過程』の分子機構の包括的理解は集積しつつある重要性の指摘に反してひときわ立ち後れている。本申請では、モデル生物（出芽酵母）の利点を駆使し、【１】 翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学、【２】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発を実施し基礎生物学、さらには医学領域への貢献も目指します。
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| 研究実績の概要 |
本年度、分子遺伝学手法の特性などを考慮し計４年間で実施する研究の第二年度として、計画【1】の分子遺伝学的解析のパイロット実験から更に進んだ候補因子た機能ドメインの特定に成功し公表した。また、計画【2】の実践投入の予備的実験を踏まえた実験計画を継続して行なった。
【１】翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学解析。
分子遺伝学的手法（forward/reverse genetics法）で、tRNA擬態蛋白質が関わる翻訳終結機構・蛋白質合成品質管理機構をモニターするアッセイ株を用い、新規因子およびその機能部位探索を実施した。得られた因子の既知因子（ASC1, S20等）の分子表面上にHel2相互作用ドメイン特定し分枝機能モデルを提唱した（論文公表済）。新規な因子の変異体がクラスターする領域として新たな機能ドメインを特定した。
【２】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発
本研究計画では、正常・異常翻訳終結にかかわる因子群にRNA編集酵素を融合した因子を細胞内に導入することで、mRNA遺伝暗号読み枠上のどのような領域（配列コンテキストや、5’CAP-mRNA-polyA tail構造上の相対位置）でリボソームにアクセスするかを細胞全体のトランスクリプトーム上にマップすることができる。本年度は、昨年度につづき必要な遺伝子コンストラクト、発現系を用いた予備実験を行っている。リボソーム再生因子ABCE1について、多角的な変異体を用いた解析の結果、翻訳終結-リボソーム再生-翻訳開始の各ステップの関連性の解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
堅実な成果公表を行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究計画は、分子遺伝学手法の特性などを考慮し、計4年間で実施する。今年度は昨年度に引続き、計画【1】の分子遺伝学的解析の基礎的 なシステム構築パイロット実験もとにした実験を進める。また、計画【2】の実践投入の予備的実験を踏まえた実験を実施する。
【１】翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学解析。
本年度は、新たに特定した因子および、機能ドメインに対して、公表済みの機能ドメインレベルの解析を実施する。以下の手順は前年度と共通する。
[1-1] reverse genetics法による機能検証実験:生化学・構造生物学的解析から得られている情報を活用し、正常・異常な翻訳終結に関わる 因子群の変異体作成を行う。[1-2] reverse genetics法による機能検証実験:これまでに指摘の無かった新規機能構造、因子の探索を開始する 。昨年度までに同定した翻訳終結に関連するリボソームタンパク質(A site構成要素)および関連因子の新規な機能ドメイン変異を他の周辺因子に拡張した探索を進める。
【2】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発 本研究計画では、正常・異常翻訳終結にかかわる因子群にRNA編集酵素を融合した因子を細胞内に導入することで、mRNA遺伝暗号読み枠上のどのような領域(配列コンテキストや、5’CAP-mRNA-polyA tail構造上の相対位置)でリボソームにアクセスするかを細胞全体のトランスクリプトーム上にマップする 今年度は新規ドメインと、昨年明らかにしたABCE1変異の解析も合わせて行い最終的な機能モデル推定する。
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