| 研究課題/領域番号 |
20H03196
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 教授 (80379304)
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| 研究分担者 |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
井田 隆徳 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 准教授 (00381088)
永田 さやか 南九州大学, 健康栄養学部, 准教授 (00452920)
海野 昌喜 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 教授 (10359549)
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)
2023年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2022年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2021年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2020年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円)
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| キーワード | 鉄硫黄クラスター / X線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡解析 / 無酸素環境実験 / 窒素固定 / 立体構造 / 窒素固定遺伝子群 / ATPase |
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| 研究開始時の研究の概要 |
鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かりな蛋白質群を必要とする。本研究では、Fe-Sクラスターを試験管内で人為的に合成する系を確立する。確立した系を利用することによって、複雑なFe-Sクラスター合成反応を自在にコントロールし、生合成の各ステップを分子レベルで捉える。
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| 研究実績の概要 |
鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かり な蛋白質群を必要とする。本研究課題ではその"心臓部"といえるSufBCD複合体に焦点をあてる。この複合体は ATP 加水分解に共役して、鉄と硫黄原子をFe-Sクラ スター へ変換する。本研究の目的は、酸素に不安定なFe-Sクラスター合成超複合体の作動メカニズムの全容解明である。また、窒素条件および低酸素条件を感知 するタンパク質CnfRに関して、構造機能解析を進める。本年度は以下の項目を実施した。
(i) SufBCD複合体の構造変化状態での構造解析：構造変化状態は一過的であり、その瞬間を捉えることに難航していた。そこで、ATP依存的に分子内架橋を形成することによるロック状態で構造解析することを試みた。その結果、人工的に導入したシステイン残基による分子内架橋によりATP結合状態を保持できることがわかった。ATP結合状態をロックすることで、機能状態を反映できていると考えている。
(ii)鉄硫黄タンパク質の中性子構造解析：鉄硫黄クラスターをもつタンパク質は、さまざまな配位状態を持つことが知られており、それぞれの状態での酸化還元電位も異なる。この鉄硫黄クラスターの形成・崩壊にともなう機能変化、とくに水素原子が機能に与える影響を調べるために、中性子構造解析による水素原子を含む高精度分析をおこなった。
(iii)窒素固定のマスターレギュレーターCnfRの構造解析に向けた巨大複合体の作成にむけ、結合するDNA断片（配列）を決定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画において、「 無酸素条件下における"無細胞"クラスター合成系の確立」と「窒素固定のマスターレギュレーターCnfR&ChlRの機能解析を掲げていた。上記、実績の(i)~(ii)がクラスター合成系の確立に関する進捗であり、(iii)はCnfRおよびChlRの機能解析に該当する。
なお、R4年11月に実験室上階からの大規模な漏水により、研究代表者の実験室の多くの機器が故障し、保管していたすべての蛋白質結晶が測定に使用できないことが判明した。装置を修理後、さらに無酸素条件下での精製をやり直したことから、計画からやや遅れた進捗になっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに得られている複合体の構造機能解析に加え、今後は以下の項目を進める。
[1]SufBCD複合体の構造変化状態での構造解析
[2]鉄硫黄タンパク質の中性子構造解析で予想した機能の検証
[3]窒素固定のマスターレギュレーターCnfR巨大複合体の構造決定（X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡解析）
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