高次生命現象に関わるタンパク質を解析できる単一細胞特異的プロテオーム解析法の開発

• 研究課題/領域番号: 20J00905
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分27040:バイオ機能応用およびバイオプロセス工学関連
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 油屋 駿介 九州大学, 生体防御医学研究所, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2020-04-24 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: プロテオミクス解析 / C. elegans / Caenorhabditis elegans / プロテオミクス / Cell-selective BONCAT

研究開始時の研究の概要

本研究では線虫の単一神経細胞をアジド基で特異的に標識し、標識した細胞を50～100匹の線虫から回収することで、少数の線虫から目的神経細胞特異的なプロテオミクス解析を行うことを目的とする。本研究課題を行うために (1) 非天然アミノ酸による線虫一細胞特異的なタンパク質のin vivo標識 (2) 少数線虫個体から目的細胞特異的なタンパク質を調製するためのin capillary調製法の開発 の二点を行う。
最終的にはこれら二点を統合し記憶などの高次生命現象に伴って線虫の目的神経細胞で変動するタンパク質群を探索する。

研究実績の概要

本研究では線虫の単一神経細胞をアジド基で特異的に標識し、標識した細胞を50～100匹の線虫から回収することで、少数の線虫から目的神経細胞特異的なプロテオミクス解析を行うことを目的とする。
本年度は(1) 単一神経細胞に変異型フェニルアラニルtRNA転移酵素 (変異RS)を発現させるためのベクターの最適化 (2) 遺伝子回路を用いた単一神経細胞における変異RSの発現 の2点を主に行った。
(1) 単一神経細胞に変異RSを発現させるためのベクターの最適化
従来のベクターでは一部の細胞特異的なプロモーターにおいて変異RSを発現させることができなかった。そこで本年度はベクターのコザック配列を検討することで、従来と比べて発現量が多いベクターを構築した。コザック配列を検討することで、従来のコザック配列では発現することができないプロモーターにおいて、変異RSを発現することが可能となった。
(2) 遺伝子回路を用いた単一神経細胞における変異RSの発現
従来のベクターを用いると、2つのプロモーターを組み合わせなければ単一の神経細胞に変異RSを発現することができない場合に対応できない。そこでsplit cGALシステム (et al PNAS) を用いて、二つのプロモーターが共通で機能する細胞のみに変異RSを発現できるシステムを構築した。さらに、1つのプロモーターだけが機能して、もう一方のプロモーターが機能しない場合に発現するシステムをcGALシステムとCRE-Loxシステムを組み合わせで検討した。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Produced β-hydroxybutyrate after β-hydroxy-β-methylbutyrate (HMB) administration may contribute HMB function in mice. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ikeda K#, Takahashi M#, Aburaya S, Harada D, Ikeda M, Kitagawa Y, Soma Y, Izumi Y, Bamba T, Furuse M*.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Rep. 巻: 27 ページ: 101097-101097
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2021.101097
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Porphyromonas gingivalis induces entero-hepatic metabolic derangements with alteration of gut microbiota in a type 2 diabetes mouse model. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kashiwagi Y#, Aburaya S#, Sugiyama N#, Narukawa Y, Sakamoto Y, Takahashi M, Uemura H, Yamashita R, Tominaga S, Hayashi S, Nozaki T, Yamada S, Izumi Y, Kashiwagi A, Bamba T, Ishihama Y, Murakami S*.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 11(1) 号: 1 ページ: 18398-18398
  • DOI: 10.1038/s41598-021-97868-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Peptide barcoding for one-pot evaluation of sequence?function relationships of nanobodies (2021)
  • 著者名/発表者名: Matsuzaki Yusei、Aoki Wataru、Miyazaki Takumi、Aburaya Shunsuke、Ohtani Yuta、Kajiwara Kaho、Koike Naoki、Minakuchi Hiroyoshi、Miura Natsuko、Kadonosono Tetsuya、Ueda Mitsuyoshi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 11 号: 1 ページ: 21516-21516
  • DOI: 10.1038/s41598-021-01019-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A three-component monooxygenase from Rhodococcus wratislaviensis may expand industrial applications of bacterial enzymes (2021)
  • 著者名/発表者名: Hibi Makoto、Fukuda Dai、Kenchu Chihiro、Nojiri Masutoshi、Hara Ryotaro、Takeuchi Michiki、Aburaya Shunsuke、Aoki Wataru、Mizutani Kimihiko、Yasohara Yoshihiko、Ueda Mitsuyoshi、Mikami Bunzo、Takahashi Satomi、Ogawa Jun
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 号: 1 ページ: 1-1
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01555-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Neuronal subclass-selective proteomic analysis in Caenorhabditis elegans (2020)
  • 著者名/発表者名: Aburaya Shunsuke、Yamauchi Yuji、Hashimoto Takashi、Minakuchi Hiroyoshi、Aoki Wataru、Ueda Mitsuyoshi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 号: 1 ページ: 1-1
  • DOI: 10.1038/s41598-020-70692-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Selected reaction monitoring for the quantification of Escherichia coli ribosomal proteins (2020)
  • 著者名/発表者名: Kosaka Yuishin、Aoki Wataru、Mori Megumi、Aburaya Shunsuke、Ohtani Yuta、Minakuchi Hiroyoshi、Ueda Mitsuyoshi
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 号: 12 ページ: e0236850-e0236850
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0236850
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 線虫Caenorhabditis elegansの神経細胞種特異的なプロテオミクス解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 油屋 駿介, 山内 悠至, 馬場 健史, 植田 充美, 青木 航
  • 学会等名: 第73回 日本生物工学会大会