| 研究課題/領域番号 |
20J00947
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
石黒 健介 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | RNA修飾 / リボソーム / クライオ電子顕微鏡 / 翻訳制御 / 結晶構造解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞活動の根幹を担う翻訳は、rRNAによって構成されるリボソームとtRNAによって進行する。rRNAは転写後に様々な修飾を受けることが知られており、翻訳の精度向上などに寄与している。本研究課題は、大腸菌で同定した嫌気環境特異的な3つのrRNA修飾による翻訳制御機構の解明を目的としている。この目的のため、①in vitro翻訳アッセイを用いたrRNA修飾が関与する翻訳素過程の解明、②Cryo-EMを用いたrRNA修飾によるリボソームの構造変化の測定を行う。以上の解析で、リボソームの構造変化を通じた環境応答の詳細な機構を世界で初めて明らかにすることを目指す。
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| 研究実績の概要 |
近年、リボソームが環境に応じてダイナミックに組成を変化させ、翻訳や細胞の生育を制御することが示唆されつつある。しかし、その詳細な機構は依然としてほとんど明らかとなっていない。本研究では、申請者が大腸菌で同定した嫌気環境特異的な3つのrRNA修飾による翻訳制御機構の解明を進めた。採択前までの申請者の研究により、これらの修飾は嫌気環境依存的に修飾率が上昇し、リボソームの翻訳能を向上させて細胞の生育に寄与することが示唆されていた。また、前年度までの構造学的および生化学的な解析により、3つの修飾がPTCの構造安定化を通じてペプチド転移反応効率を向上させ、嫌気環境での細胞生育に貢献していることが示唆された。また、RlmPの最小基質として23S rRNAのHelix 89を中心とする100base程度のRNAを特定した。
本年度は、RlmPの結晶化による構造解析を中心に進めた。当初通常の環境でapo-RlmPを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、嫌気チャンバー内でholo-RlmPの再構成を行った上で結晶化スクリーニングを行った。その結果、いくつかの条件でタンパク質結晶らしきものを検出することができたが、高解像度の回折像を得ることはできなかった。また、最小基質のRNAを等モル混ぜた条件でも結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、Cryo-EMによるRlmPの構造解析を試みた。まず、apo-RlmPについて酵素の基質となるSAMやMeCbl、rRNA最小基質などの添加の有無により幾つか条件を振りgridの作成およびCryo-EMによる試測定を行った。その結果酵素らしき粒子がMicrograph上で確認できたため、現在pickingの条件などの検討を進めている。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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