計算化学・遺伝子工学・分子生物学を基盤とした植物二次代謝酵素の解析と設計

• 研究課題/領域番号: 20J01256
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分37020:生物分子化学関連
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 佐藤 玄 千葉大学, 薬学研究院, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2020-04-24 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2020年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2020年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: アルカロイド / DFT

研究開始時の研究の概要

本研究では、マメ科植物から単離される天然物キノリチジンアルカロイドの生合成に関わるリジン脱炭酸酵素の機能解析と機能改変に、実験科学・計算化学の両面からのアプローチを用いて取り組む。キノリチジンアルカロイド生合成の初発段階を触媒するリジン脱炭酸酵素は、リジンとオルニチンの両方を基質として受け入れる二機能性酵素として植物内で働いているが、キノリチジンアルカロイドの生産効率向上のためには、リジン選択性の向上という解決すべき課題がある。

研究実績の概要

採用からわずか９ヶ月間の研究期間ではあったが、当初の計画よりも研究が進展したと考えている。ホソバルピナス由来のリジン・オルニチン脱炭酸脱炭酸酵素 (L/ODC)については、共同研究者の取得した X 線結晶構造解析に基づき、約 30 種類の変異体酵素の作成とその活性評価を行うことができ、各アミノ酸側鎖がどのように酵素活性に寄与しているかを明らかにすることが出来た。また、研究計画に従い、L/ODC の近縁酵素であるアルギニン脱炭酸脱炭酸酵素 (ADC)、ジアミノピメリン酸脱炭酸脱炭酸酵素 (DapDC)との比較も進めた。ホソバルピナス（Tanjil品種）から La-DapDC と La-ADC をそれぞれクローニングしてくることに成功し、このうち、La-DapDC については、in vitro で酵素活性を確認することが出来た。また、La-L/ODC と La-DapDC の構造を計算化学により比較することにより、重要なアミノ酸残基を予測した。その結果、La- L/ODC F344H と La- L/ODC F344Y という2種の点変異体酵素が DapDC 活性を示すことを見出した。このことは、酵素の基質特異性や反応機構に新たな知見を与えるに留まらず、L/ODC 近縁種の酵素の進化の議論にもつながる大きな成果であると考える。
また、40 年以上にわたり謎とされてきたブラシラン型骨格の生合成反応機構を計算化学を駆使することによって明らかにし、アメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc.）に掲載され、表紙にも選出された。さらに、多様な天然物骨格の構築を目的とし、酸化酵素の反応機構解析にも取り組み、インドールジテルペン化合物 Lolitrem 生合成研究におけるラジカル閉環反応の詳細を明らかにすることに成功し、Angew. Chem. Int. Ed. 誌に掲載された。

現在までの達成度 (段落)

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

今後の研究の推進方策

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] DFT Study on the Biosynthesis of Preasperterpenoid A: Role of Secondary Carbocations in the Carbocation Cascade (2020)
  • 著者名/発表者名: Sato Hajime、Yamazaki Mami、Uchiyama Masanobu
  • 雑誌名: ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＆ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＢＵＬＬＥＴＩＮ 巻: 68 号: 5 ページ: 487-490
  • DOI: 10.1248/cpb.c20-00037
  • NAID: 130007838788
  • ISSN: 0009-2363, 1347-5223
  • 年月日: 2020-05-01
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] DFT Study of a Missing Piece in Brasilane-Type Structure Biosynthesis: An Unusual Skeletal Rearrangement (2020)
  • 著者名/発表者名: Sato Hajime、Hashishin Takahiro、Kanazawa Junichiro、Miyamoto Kazunori、Uchiyama Masanobu
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 142 号: 47 ページ: 19830-19834
  • DOI: 10.1021/jacs.0c09616
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biosynthesis of Indole Diterpene Lolitrems: Radical-Induced Cyclization of an Epoxyalcohol Affording a Characteristic Lolitremane Skeleton (2020)
  • 著者名/発表者名: Yulu Jiang, Taro Ozaki, Mei Harada, Tadachika Miyasaka, Hajime Sato, Kazunori Miyamoto, Junichiro Kanazawa, Chengwei Liu, Jun-ichi Maruyama, Masaatsu Adachi, Atsuo Nakazaki, Toshio Nishikawa, Masanobu Uchiyama, Atsushi Minami, Hideaki Oikawa
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 59 号: 41 ページ: 17996-18002
  • DOI: 10.1002/anie.202007280
  • NAID: 120007160289
  • 査読あり