難治性固形癌への効率的抗体デリバリーを可能とする二段階送達システムの開発

• 研究課題/領域番号: 20J11536
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分50020:腫瘍診断および治療学関連
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 山内 聡一郎 熊本大学, 薬学教育部, 特別研究員(DC2)
• 研究期間 (年度): 2020-04-24 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2021年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2020年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: 環状一本鎖抗体 / インテイン反応 / Diabody / avidity効果 / PEG化 / 抗HER2抗体 / 次世代抗体モダリティ / 分子動力学計算

研究開始時の研究の概要

本研究では、環状scFvと近赤外光応答性ナノ粒子の融合により、EPR効果の付与および癌間質でのscFv放出を可能とする環状scFvの二段階送達システムの構築を目指す。独自に開発した環状scFv可溶性発現システムを活用することで効率良く環状scFvを大量調製し、その生物活性および体内動態等を細胞・動物実験により評価する。その後、環状scFvを封入した近赤外光応答性リポソームを作製し、動物実験により生物活性および体内動態等について評価を行い、本システムの有効性を確認する。

研究実績の概要

以下に本年度の研究において得られた知見をまとめる。
（1）インテイン反応を利用した大腸菌体内環状scFv調製法を用いてTrastuzumab由来の環状scFv（Tras-scFv）を調製した。本手法で調製した環状scFvは連結部分に新たなシステイン残基が導入される。このシステイン残基を利用してscFvの欠点である抗原結合価数の減少による抗原結合力の低下を補うために、チオール反応性の官能基を持つ架橋剤を用いて環状Tras-scFv二量体を調製した。表面プラズモン共鳴（SPR）測定の結果、環状Tras-scFv単量体と比較して、環状Tras-scFv二量体はavidity効果により抗原結合力が向上していることを確認した。
（2）環状scFvの保存安定性および血中滞留性の向上を目指し、環状Tras-scFv中のシステイン残基に対して様々な分子量の直鎖型および分岐型PEG鎖を部位特異的に修飾したPEG化環状scFvを調製した。Trastuzumab-HER2複合体立体構造から、PEG修飾部位はscFvの抗原認識部位とは反対側に位置することを確認したため、PEG修飾は環状scFvの抗原結合活性に影響を与えないと予想した。実際にSPR測定による解析を行った結果、PEG修飾による抗原結合活性の大幅な低下は確認されなかった。続いて、保存安定性に関して検討した結果、PEG修飾により耐熱性および凍結乾燥後の溶解性が有意に向上することが明らかとなった。また、健常マウスを用いた体内動態解析を行った結果、PEG修飾による分子量増大に伴い、環状Tras-scFvの消失半減期が最大で15倍延長した。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Expression, Purification and Characterization of CAR/NCOA-1 Tethered Protein in <i>E. coli</i> Using Maltose-Binding Protein Fusion Tag and Gelatinized Corn Starch (2021)
  • 著者名/発表者名: Kobashigawa Yoshihiro、Namikawa Mana、Sekiguchi Mitsuhiro、Inada Yuki、Yamauchi Soichiro、Kimoto Yuu、Okazaki Kyo、Toyota Yuya、Sato Takashi、Morioka Hiroshi
  • 雑誌名: Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 巻: 44 号: 1 ページ: 125-130
  • DOI: 10.1248/bpb.b20-00759
  • NAID: 130007965289
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • 年月日: 2021-01-01
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular recognition of a single-chain Fv antibody specific for GA-pyridine, an advanced glycation end-product (AGE), elucidated using biophysical techniques and synthetic antigen analogues. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kobashigawa, Y., Ohara, T., Morita, K., Toyota, Y., Nakamura, T., Kotani. S., Arimori, T., Yamauchi, S., Liu, C., Kitazaki, M., Wakeyama-Miyazaki, Y., Suwa, Y., Uchida-Kamekura, M., Fukuda, N., Sato, T., Nakajima, M., Takagi, J., Yamagata, Y., and Morioka, H
  • 雑誌名: J. Biochem 巻: 170 号: 3 ページ: 379-387
  • DOI: 10.1093/jb/mvab056
  • NAID: 40022721879
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Convenient method of producing cyclic single-chain Fv antibodies by split-intein-mediated protein ligation and chaperone co-expression (2020)
  • 著者名/発表者名: Liu Chenjiang、Kobashigawa Yoshihiro、Yamauchi Soichiro、Fukuda Natsuki、Sato Takashi、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio、Morioka Hiroshi
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 168 号: 3 ページ: 257-263
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa042
  • NAID: 40022375418
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 一本鎖抗体の製剤特性改善に向けたPEG修飾の有用性評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山内聡一郎、佐藤卓史、小橋川敬博、水田夕稀、前田仁志、渡邉博志、丸山徹、森岡弘志
  • 学会等名: 第94回 日本生化学会大会
• [学会発表] Cyclic scFv : A low molecular weight antibody with reduced aggregation propensity for biomedical use (2020)
  • 著者名/発表者名: Soichiro Yamauchi, Chenjiang Liu, Natsuki Fukuda, Takashi Sato, Yoshihiro Kobashigawa, Hiroshi Morioka
  • 学会等名: 第20回 日本蛋白質科学会年会
• [図書] 創薬研究のための相互作用解析パーフェクト (第1章 II-12「ファージディスプレイ法を用いた一本鎖抗体の改変」) (2021)
  • 著者名/発表者名: 山内 聡一郎、小橋川 敬博、佐藤 卓史、森岡弘志
  • 総ページ数: 11
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 9784758122566
• [備考] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野ホームページ
  • URL: http://seimeibunseki.org
• [備考] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野ホームページ
  • URL: http://seimeibunseki.org
• [産業財産権] PEG化環状一本鎖抗体 (2020)
  • 発明者名: 森岡 弘志、小橋川 敬博、佐藤 卓史、山内 聡一郎
  • 権利者名: 熊本大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2020