| 研究課題/領域番号 |
20J13346
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分43040:生物物理学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
本田 信吾 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2021年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2020年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | デジタルバイオアッセイ / デジタルバイオ分析 / 一分子計測 / 一粒子計測 / 多次元計測 / インフルエンザウイルス / アルカリフォスファターゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
インフルエンザウイルス表面の酵素ノイラミニダーゼ (NA)は感染に重要であり、NA阻害剤 (NAI)はインフルエンザ治療薬として最も一般的に用いられる。一方、ウイルスを一粒子ずつ微小空間に閉じ込めNA活性を測定する技術により、NAI耐性を示さないウイルス株においても、高濃度のNAI存在下でNA活性を保持する粒子の存在が報告されている。しかし、この粒子がNAI耐性を獲得したものか、単に元のNA活性が高いものかは不明である。
本研究では、ウイルス粒子を微小空間内に保持しNAI濃度を変更できる一粒子測定技術を開発し、この粒子がNAI耐性かを明らかにし、そうであるなら、関連する遺伝型を同定する。
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| 研究実績の概要 |
今年度は、昨年度開発した多次元デジタル計測技術を、高機能酵素選抜に展開することを目標として研究に取り組んだ。結果として、酵素選抜系の基盤となるマイクロチャンバーへのDNAおよび酵素の固定技術と、固定した酵素の多次元計測技術を確立することに成功した。さらに実際の選抜を想定した実証で、多次元計測に基づき酵素変異体を判別することにも成功した。
(1) 多次元デジタル計測技術の高機能酵素選抜への展開
・昨年度開発した多次元デジタル計測技術を高機能酵素選抜に展開するため、まず選抜対象の酵素をコードしたDNAを一分子ずつチャンバー内に固定する技術を確立。
・固定した一分子DNAから各チャンバー内で酵素を発現・チャンバーに固定することで、DNAとそこにコードされた酵素をチャンバー内で対応付ける手法を確立。
・一分子DNAから発現させ固定したモデル酵素アルカリフォスファターゼ (ALP)について、阻害剤濃度を変化させながら繰り返し活性を計測し、IC50を決定することに成功。
・実際の選抜を想定した実証として、大腸菌由来ALPの2種類の変異体DNAを混合してチャンバーに固定後、酵素を発現・各チャンバーに固定し、二つの阻害剤 (リン酸、バナジン酸)に対するIC50をDNA一分子ごとに決定した。そして二つのIC50に基づき2種類の変異体DNAを区別できるか検証した。その結果、2種類の変異体DNAを正しく区別できることが実証された。今後チャンバーからDNAを回収する手法を開発することで、これまでにない評価軸で高機能酵素を選抜できる系が確立できると期待される。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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