クライオ電子顕微鏡を用いたClass B GPCRの単粒子構造解析

• 研究課題/領域番号: 20J21820
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 審査区分: 小区分48040:医化学関連
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小林 和弘 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2020-04-24 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2022年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2021年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2020年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
• キーワード: GPCR / 単粒子構造解析 / クライオ電顕 / 慢性疾患 / 副甲状腺ホルモン受容体 / 細胞内作動薬 / シグナルバイアス / 副作用制御

研究開始時の研究の概要

Class B GPCRはペプチドホルモンを受容する受容体群であり、内分泌系制御に関わる慢性疾患の創薬標的として広く知られている。近年、単粒子構造解析によりいくつかの受容体が構造決定されたが、リガンド認識に関わる細胞外ドメイン(ECD)がリガンドを識別するメカニズムや受容体活性化に寄与する構造的知見は不十分である。
本研究では単粒子構造解析により、Class B GPCRであるPAC1受容体及びPTH受容体について活性化状態の構造解析を行う。また、親和性の異なるリガンドとの複合体構造解析も行うことで、ECDがリガンドの親和性や受容体活性化に寄与するメカニズムを明らかにする。

研究実績の概要

本年は副甲状腺ホルモン受容体(PTH1R)を介した骨粗しょう症治療における最大の問題点の一つである副作用の発現機構について、その分子機構を明らかにした。これまでに、アミノ酸1字配列に基づいてPTHの持つ強い造骨能とPTHrPの持つ弱い副作用を兼ね備えた新規骨粗しょう症治療薬が探索され、LA-PTHが製造された。しかし、予想に反してLA-PTHはPTHよりも強い副作用が生じ、PTH1Rを介した副作用発現機構の分子基盤は不明であった。申請者はPTH1RによるPTH及びPTHrPの認識機構を解明し、PTHによる副作用発現について1アミノ酸のレベルで解明した。また、計算機シミュレーションを用いることで、タンパク質レベルでの副作用発現機構と、細胞レベルでの副作用発現機構の画一的な理解を可能とした。加えて、先行研究のLA-PTHが予想に反して強い副作用を生み出す分子メカニズムも明らかにし、理想的な骨粗しょう症治療薬開発に向けた創薬戦術を提案した。
さらに、本年はPTH1Rに対する非ペプチド 性作動薬(PCO371)の認識機構を明らかにした。この構造からはPCO371はこれまで見つかっていなかった新規の細胞内ポケットに結合し、PCO371の受容体活性化メカニズムは一般的なGPCRの作動メカニズムとは異なっていることが明らかになった。PCO371は細胞内領域のみを直接活性化構造に固定することが可能であり、PTH1RによるGタンパク質とβ-arrestinの結合能を直接制御することでGタンパク質のみを活性化することが明らかになった。これらの事実から細胞内領域を介したバイアスドシグナリングという全く新しい概念が提案された。最後に、このPCO371の結合する薬剤ポケットは15の受容体に保存されていることを明らかにし、PCO371は少なくとも7個の受容体を活性化できることを明らかにした。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] A novel activation mechanism of class B1 GPCRs via an intracellular pocket (2023)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Kobayashi, Kouki Kawakami, Tsukasa Kusakizako, Atsuhiro Tomita, Michihiro Nishimura, Kazuhiro Sawada, Hiroyuki H. Okamoto, Suzune Hiratsuka, Gaku Nakamura, Riku Kuwabara, Hiroshi Noda, Hiroyasu Muramatsu, Masaru Shimizu, Tomohiko Taguchi, Asuka Inoue, Takeshi Murata, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: -
• [雑誌論文] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Miyauchi Hirotake、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Shihoya Wataru、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kato Hideaki E.、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 18 ページ: 3468-3483
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.07.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structure of the human PAC1 receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Kazuhiro、Shihoya Wataru、Nishizawa Tomohiro、Kadji Francois Marie Ngako、Aoki Junken、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 27 号: 3 ページ: 274-280
  • DOI: 10.1038/s41594-020-0386-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure of the human secretin receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Fukuhara Satoshi、Kobayashi Kazuhiro、Kusakizako Tsukasa、Iida Wataru、Kato Masahiko、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 533 号: 4 ページ: 861-866
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.08.042
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2023)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Kobayashi
  • 学会等名: GPCR workshop 2023
  • 国際学会
• [学会発表] Cryo-EM structure of class B GPCR structures (2022)
  • 著者名/発表者名: 小林和弘
  • 学会等名: 第21回 東京大学生命科学シンポジウム
• [学会発表] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: 小林和弘
  • 学会等名: 第41回 骨代謝学会
• [学会発表] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: 小林和弘
  • 学会等名: 第95回 日本生化学会
• [学会発表] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: 小林和弘
  • 学会等名: 第17回 GPCR研究会
• [学会発表] Cryo-EM structure of the human PAC1 receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Kobayashi, Wataru Shihoya, Tomohiro Nishizawa, Francois Marie Ngako Kadji, Junken Aoki, Asuka Inoue & Osamu Nureki
  • 学会等名: 第20回 東京大学生命科学シンポジウム BIO UT
• [学会発表] Cryo-EM structure of the human PAC1 receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro Kobayashi, Wataru Shihoya, Tomohiro Nishizawa, Francois Marie Ngako Kadji, Junken Aoki, Asuka Inoue & Osamu Nureki
  • 学会等名: 第58回 日本生物物理学会