| 研究課題/領域番号 |
20J22783
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分27040:バイオ機能応用およびバイオプロセス工学関連
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
山本 美月 山梨大学, 医工農学総合教育部, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2022年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2021年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2020年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | Directed evolution / SELEX / PUREシステム / cDNAディスプレイ / 蛍光ラベリング / 部位特異的ラベリング / 反応性ペプチドタグ / ノックダウン / ジベンゾシクロオクチン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
バイオイメージングは生体分子の動態をリアルタイムに画像として解析できる技術である。
その中心的存在の蛍光タンパク質は優れた特性がある一方、低分子蛍光プローブと比較すると不十分な蛍光特性と巨大なタグサイズによる標的タンパク質の機能阻害の問題点が存在する。これに対して、小分子を介して標的タンパク質に光学特性の高い非タンパク質性蛍光プローブを修飾させる小分子結合タンパク質タグが開発されたが、依然タグサイズの問題は解決されていない。本研究では、分子進化工学的スクリーニング探索により小分子に結合する低分子量の新規ペプチドタグを開発し、小分子蛍光プローブによるバイオイメージングへの応用を行う。
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| 研究実績の概要 |
これまでに、PURE（Polypeptide synthesis Using Recombinant Elements）システムにより調製した数兆種類のcDNAディスプレイ型ペプチドタグライブラリーからのSELEXスクリーニングにより同定した新規小分子結合ペプチドタグについて、動物細胞内に発現させた合成小分子反応性ペプチドタグ融合タンパク質を、蛍光プローブで修飾した合成小分子で処理し、蛍光顕微鏡観察を行なった結果、合成小分子反応性ペプチドタグに特異的に蛍光ラベルがされていること、複数種類の動物細胞株（HEK293、COS-7、HeLa等）内で蛍光ラベル・イメージングが可能であること、様々なタンパク質（核局在GFP、チューブリン、ヒストン等）を蛍光ラベル・イメージング可能であること、複数種類の蛍光プローブ（青色クマリン、緑色フルオレセイン、赤色TMR、近赤外SiR等）で蛍光ラベル・イメージング可能であることが判明していた。そこで更に、動物細胞内に発現させた合成小分子反応性ペプチドタグ融合タンパク質を、ユビキチンリガーゼ結合リガンドで修飾した合成小分子で処理し、蛍光顕微鏡観察や免疫ブロッティング、発光測定による解析を行なった結果、様々なタンパク質（GFP、核局在GFP、アクチン、チューブリン、ヒストン、ルシフェラーゼ等）の分解誘導によるノックダウンが可能であること、複数種類の動物細胞株（HEK293、COS-7、HeLa等）内で分解誘導によるノックダウンが可能であることが判明した。
本研究成果は、日本農芸化学会2023年度大会および第74回日本生物工学会大会の学会で成果発表を行なっている。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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