| 研究課題/領域番号 |
20K05775
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38010:植物栄養学および土壌学関連
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
上野 大勢 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (90581299)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2020年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
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| キーワード | イネ / マンガン / カルシウム / トランスポーター / 石灰質のアルカリ土壌 / 輸送体 / 局在性 / 石灰質アルカリ土壌 / 石灰質土壌 / アルカリ土壌 / マンガン欠乏 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は食料増産のために，石灰質アルカリ土壌における稲作の実現を目指し，イネのマンガン欠乏耐性分子機構を解明することを目的とする。石灰質アルカリ土壌を模した低マンガン/高カルシウム条件で特異的に発現レベルが増減する遺伝子群を網羅的に解析することにより，生理的マンガン濃度の維持に関わる候補遺伝子を選抜する。続いて，分子生物学的・生理学的各手法を用いて機能を詳細に解析し，候補遺伝子の植物体内における生理的役割を明らかにすることによって，石灰質アルカリ土壌におけるマンガン欠乏応答分子機構の統合理解を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究は高カルシウム(Ca)/低マンガン(Mn)環境の石灰質のアルカリ土壌における稲作の実現を目指し，イネのMn欠乏耐性分子機構を解明することを目的とする。endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 3 (ECA3)はCa/Mnポンプの一種である。先行研究において、eca3欠損株はMn欠乏時に野生株に対して大きく生育が阻害されたが、Mnの輸送活性や細胞内局在性は未解明であった。本年度は、パーティクルガン法によりGFP融合遺伝子の一過性発現解析により細胞内局在を調べた。GFP:ECA3の蛍光はタマネギ表皮細胞中で粒状に観察された。このため、mRFPで標識した各種ゴルジ関連区画マーカー［タンパク質 (区画)；SYP31 (シスゴルジ)、Xylt (メディアルゴルジ)、KAM1ΔCおよびST (トランスゴルジ)、SYP61 (TGN)、VSR2 (PVC)］と局在を比較した。KAM1ΔC:mRFP とST:mRFPの蛍光はGFPの蛍光と近接していたものの、ややずれた位置で観察された。Xylt:mRFPの蛍光も同様で、GFPの蛍光と完全には一致しなかった。mRFP:SYP61の蛍光は粒状に観察されたものの、十分な光度が得られずGFPとの比較が困難であった。mRFP:VSR2とmRFP:SYP31は蛍光が粒状に観察されず、タマネギ表皮細胞を用いた本解析には使えなかった。以上の結果から、オルガネラの特定には至らなかったものの、ECA3はゴルジ関連区画に局在すると考えられる。また、酵母発現系により輸送活性を調べるため、Mn感受性の酵母pmr1にpYES2-ECA3と-MTP8.1(ポジティブコントロール)を発現させた。しかし、Mn過剰区において、MTP8.1発現株でMn感受性が相補されたのに対し、ECA3発現株では生育が改善しなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2年目までのコロナ禍による研究活動の制限により、進捗状況に大きな遅れが発生しており、研究期間を延長するに至った。
本年度行ったGFP融合タンパク質の一過性発現解析では、ECA3のゴルジ関連区画への局在が強く示唆された。しかし、シロイヌナズナ由来のゴルジ関連区画マーカーのいくつかが、タマネギ表皮細胞では局在せず細胞質に拡散してしまうことが明らかになり、解析手法を再検討する必要がある。
また、輸送活性に用いたMn感受性株はゴルジ局在型ポンプPMR1の欠損株であり、ECA3の解析には最適と考えられた。それにも関わらず、輸送活性が見られなかったのは酵母における誤局在が疑われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ECA3の細胞内局在性の解析はタマネギ表皮細胞ではなく、イネのプロトプラストまたは、ゴルジ関連区画マーカーの正確な局在が見込めるシロイヌナズナのプロトプラストを用いて再検討する。発現や局在性に問題が生じた場合は、ウェスタンブロッティングにより検討する。酵母発現ベクターpYES2はハイコピープラスミドであることに加え、GAL1プロモーターが下流の遺伝子の発現を非常に強く誘導する。そのため、トランスポーターが適切な膜に局在すれば明瞭な表現型が示される。一方、発現レベルが高すぎることは、タンパク質が小胞体に保留されたままになる問題を発生させる。この問題は、発現誘導レベルの低いベクターと代替することで解決する可能性がある。具体的には1コピーがゲノムに挿入されるインテグレーションベクターや、GAPDHプロモーターを用いて再検討する。また、pmr１株以外のMn輸送体遺伝子欠損株や、大腸菌を用いることで、輸送活性の解析を試みる。また、ECA3のホモログの二重変異株eca1eca2のフェノタイプを解析し、同輸送体ファミリーのMnとCaの恒常性における役割の解明を目指す。
さらに、トランスクリプトーム解析により、野生株に対しeca3欠損株で高発現していることがわかった新規トランスポーター遺伝子（Similar to Nodulin 21）についても、欠損の影響、局在性、輸送活性などを明らかにする。
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