窒素固定能を付与した大腸菌による窒素源添加が不要な発酵生産プロセスの基盤構築

• 研究課題/領域番号: 20K05800
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分38020:応用微生物学関連
• 研究機関: 地方独立行政法人大阪産業技術研究所
• 研究代表者: 駒 大輔 地方独立行政法人大阪産業技術研究所, 森之宮センター, 主任研究員 (80443547)
• 研究分担者: 古屋 俊樹 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (20367064)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2020年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: 窒素固定 / 大腸菌 / ニトロゲナーゼ / 合成生物学 / アセチレンアッセイ / 人工オペロン / Klevsiella / 比色法 / リグヘモグロビン / 発酵生産

研究開始時の研究の概要

持続可能な社会の構築に向けたバイオプロセスの研究開発では、化石資源からバイオマス資源への「炭素源」の転換に重点が置かれてきた。しかし、発酵生産の際に培地へ添加する「窒素源」の製造にも多大な化石エネルギーが使われている。そこで、培地への窒素源添加が不要な発酵生産プロセスの開発を目指し、発酵生産菌に窒素固定能を付与することを検討する。本研究では「大腸菌に適したニトロゲナーゼクラスター（窒素固定能）」と「ニトロゲナーゼを酸素から防御するシステム（酸素防御システム）」を大腸菌の染色体に導入し発現させることで、大気中の窒素分子を用いて生育し、かつアミノ酸を発酵生産できる菌株を作製する。

研究成果の概要

窒素源をハーバー・ボッシュ法に依存しない新たな発酵生産プロセスの開発を目指した。具体的には、より好気的な条件下（発酵生産条件下）で、窒素固定できる大腸菌の作製を目指した。大腸菌と同じ科に属するKlebsiellaのニトロゲナーゼクラスターの遺伝子をクローニングし、大腸菌の染色体に導入することで、より野生型の窒素固定菌に近い状態を作り出して発現させることを試みた。リアルタイムPCRの結果から、すべての遺伝子が目的どおりに発現していることが明らかとなったが、ニトロゲナーゼの活性は、窒素固定を行うには不十分な値であった。よって、活性を増強させるようなさらなる遺伝的改変が必要であることが示唆された。

研究成果の学術的意義や社会的意義

学術的な意義として、14種類のKlebsiellaの遺伝子を導入しただけでは、大腸菌は窒素固定せず、窒素固定の達成には別のファクターが必要であることを明らかにした。開発した菌株は染色体改変株であるので、さまざまな遺伝的改良が容易で、今後、ひとつのプラットホーム菌株としての活用が可能であり、学術貢献度は高い。また収集した各種遺伝子も同様な貢献が可能である。
社会的な意義として、現在、窒素をエネルギーキャリアーとして利用するための研究、また食料問題を解決するための研究など、窒素固定研究は非常に白熱している。今回、微生物による窒素固定活用という新しい分野に貢献できたことは、社会的に意義がある。