| 研究課題/領域番号 |
20K05832
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38030:応用生物化学関連
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
梶川 昌孝 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (40594437)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2020年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 藻類 / 環境応答 / 栄養欠乏ストレス / タンパク質リン酸化酵素 / 順遺伝学 / 植物分子生物学 / 栄養欠乏 / オートファジー / 藻類生理学 / 変異体解析 / 細胞内シグナル伝達 / 植物生理学 / 細胞生存性 / シグナル伝達 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
クラミドモナスは単細胞性の緑藻であり、ATG遺伝子の大半はゲノム中に１コピーのみ存在することから、シンプルなオートファジー駆動機構を持つと考えられる。本研究では、ハイスループットな変異株スクリーニングによる順遺伝学解析系が確立されたモデル緑藻クラミドモナスのatg変異株を活用し、植物界で先駆けて従来型オートファジーとは異なる新奇な細胞生存を制御する分子機構の包括的な解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究ではモデル緑藻クラミドモナスを用いて、オートファジー因子とは異なる新奇な細胞生存を制御する分子機構の解明を目指した。N・S・Pのいずれの栄養欠乏条件においても生存性が親株よりも早期に低下する変異体21B1変異株の解析を進めた。この変異体ではタンパク質リン酸化酵素遺伝子21B1に挿入変異を持つ。野生型との交配により得られた21B1遺伝子に変異をもつ子孫系統の表現型は、元の21B1変異株と同等であった。このことから、21B1変異株における生存率低下の表現型は21B1遺伝子への変異によるものであることが示唆された。21B1遺伝子に蛍光タンパク質Venus遺伝子およびFLAGタグを連結したプラスミドを構築し、21B1遺伝子の単独変異体に導入したところ、表現型の回復とともにFLAG抗体を用いたウェスタン解析において予想サイズにシグナルが見られた。細胞内のVenus由来蛍光パターンの観察により細胞内局在の推定を進めたところ、収縮胞において特異的なシグナルが見られた。一方で、リン酸化活性に必須と推定されるリジン残基をメチオニン置換した変異型21B1遺伝子を21B1遺伝子の単独変異体に導入した場合には、変異表現型を相補しない結果を得た。さらに、組換え21B1タンパク質を用いたin vitroでのタンパク質リン酸化活性評価を行ったところ、カゼインに対して中性条件でリン酸化活性を示すことがわかった。21B1タンパク質の相互作用因子を探索するために、FLAGタグ融合タンパク質発現系統から抽出した総タンパク質を用いたFLAGタグ抗体ビーズによる免疫沈降を行ったところ、複数の特異的タンパク質シグナルを得ることに成功した。
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