| 研究課題/領域番号 |
20K06462
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42040:実験動物学関連
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
垣内 一恵 北里大学, 獣医学部, 助教 (90509184)
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| 研究分担者 |
高岸 聖彦 北里大学, 獣医学部, 講師 (20216633)
久保田 浩司 北里大学, 獣医学部, 教授 (80263094)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2020年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
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| キーワード | 精原幹細胞 / 異種移植 / 精子形成 / 精細管内移植アッセイ / トランスジェニックマウス / ブタ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
精子形成を維持する精原幹細胞は、オスの配偶子を産生し続ける唯一の生殖幹細胞である。マウスでは不妊オス個体精細管への移植により継続的な精子形成を再構築するため、幹細胞活性を評価できるが、他動物種ではレシピエントとなる不妊オス個体の作製が困難なため、幹細胞活性を評価できずに研究の進展が妨げられている。
本研究ではこの問題を解決するため、トランスジェニック免疫不全マウスによる他動物種由来精原幹細胞の異種移植アッセイ系を構築し、研究室レベルで実施できる異種精原幹細胞の精細管内移植法の開発を試みる。
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| 研究実績の概要 |
家畜の精原幹細胞の同定、及び培養系の樹立が試みられているが、レシピエントとなる不妊オス個体の作製が困難なため、精原幹細胞の幹細胞活性を評価できずに研究の進展が妨げられている。本研究課題では、精原幹細胞の分化誘導因子の種特異性に着目した異種移植法の確立を目指す。
レシピエントマウス精巣に異種精原幹細胞を移植した場合、精細管内で維持はされるが精子への分化は認められないことが明らかになっている。申請者は、精原幹細胞の分化因子に種特異性が存在すると仮定し、レシピエントマウスの精巣において、ドナー動物種由来の分化因子を発現するトランスジェニックマウスを作製し、精原幹細胞の異種移植により継続的な他動物種由来の精子形成の再構築を試みる。異種移植には、既に前精原幹細胞（精原幹細胞の前駆細胞）の精製法が確立し、体外受精や受精卵の体外培養による胚発生能の有無を解析できるブタをモデルにし、ブタ由来の精原幹細胞の分化誘導因子を発現する発現ベクターを作製し、トランスジェニックマウスの作製を試みた。
これまでに、トランスジェニックマウス作製のための発現ベクターの構築と予備実験を行った。分化誘導因子を過剰発現したトランスジェニックマウスは皮膚への異常が認められることが報告されているため、当初の研究計画では、精巣組織内のセルトリ細胞で特異的に発現するヒトAMHプロモーターの下流で発現を誘導することとしたが、予備実験によりAMHプロモーターは成体マウスセルトリ細胞では発現を誘導しない可能性を示した。そこで、新たにセルトリ細胞特異的プロモーターを選択し発現ベクターを構築したところ、成体マウス由来セルトリ細胞株において発現が認められたため、現在トランスジェニックマウスの作製を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画で使用する予定であったAMHプロモーターは、成体マウス精巣で機能しない可能性が示されたため、精巣組織で特異的に機能するプロモーター配列の選択を再検討するために時間を要した。進捗が遅れたが、無事に成体マウス精巣で機能するプロモーター配列を選択し、トランスジェニックマウスの作製を開始することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の実験計画では、C57BL/6系統ファウンダーマウスを得たのち、精細管内移植法が容易なヌードマウスとファウンダーマウス（F0）との交配を行い、3世代目に50％の確率でレシピエントとして使用できる免疫不全オスマウスが得られると計画していた。しかし、交配にかかる時間を要するため、ヌードマウス受精卵にインジェクションしてトランスジェニックヌードマウスを作製することとした。半年後には、レシピエントマウスを作製し、異種移植を開始できると考えている。また、ファウンダーマウスが得られなかった場合を考慮し、ヌードマウス由来精原幹細胞株を樹立し、発現プラスミドを遺伝子導入した後に精細管内移植法と自然交配によりトランスジェニックマウスを作製することを検討し、準備を進めている。
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