| 研究課題/領域番号 |
20K06484
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
佐藤 優子 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (70435882)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2020年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | クロマチン / エピジェネティクス / ライブイメージング / 長鎖ノンコーディングRNA / X染色体不活性化 / Xist / XCI / RNA / Live cell imaging / Chromatin |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒトやマウスの性染色体は雄XY、雌XXで構成されており、雌の細胞には2本のX染色体が存在する。分化した雌細胞では片方のX染色体をほぼ全域で不活性することで遺伝子量の補正を行っている。このX染色体不活性化は、不活性化X染色体上のXist遺伝子の発現産物であるXist RNAが引き金として働いていることが分かっている。本研究では、最近新たに開発したXist RNAに対する生細胞プローブを使って、Xist RNAの細胞の中での動きを調べて不活性化機構を明らかにすることを目的とする。この研究の成果は、長鎖非コードRNAによるクロマチン制御の普遍的メカニズムの理解につながることが期待できる。
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| 研究実績の概要 |
2022年度は、クロマチン動態とヒストン修飾の関係に注目して解析を進めた。
本研究ではこれまで、X染色体上の特定の遺伝子領域について、gRNA/dCas9システムを用いて、生細胞内動態（Mean square displacement: MSD）を調べてきた。X染色体不活性化により不活性化されたX染色体では、活性化X染色体上のDNA領域よりも動きが拘束されていた。動態を調べた3か所のDNA領域のうちの1か所は、不活性化X染色体上で転写が活性化されているXist遺伝子近傍にあり、転写阻害剤の添加により動態の拘束が緩和された。したがって転写されている領域では、転写活性化によりクロマチン動態が拘束されていることが示唆された。
今年度は、ヒストン修飾のクロマチン動態への影響について、修飾酵素阻害剤の添加により調べた。不活性化X染色体に高度に蓄積されている抑制性ヒストン修飾H3K27me3を除去するため、責任酵素であるEzh1/2阻害剤（DS-3201）を添加して4日間培養した。この処理によりH3K27me3は検出できないレベルまで低下させて、前年度と同様にgRNA/dCas9システムによるDNA領域の動態観察を行った。
その結果、H3K27me3を除去した場合でも、不活性X染色体上のDNA領域の動態は拘束されており、変化はほとんど見られなかった。
そこで次に、ユークロマチンドメインとヘテロクロマチンドメインの可視化を行い、動態を調べることにした。今年度はクロマチンドメインのライブイメージングを行うための実験系を樹立した。H3K9ac-mintbodyとH3K27me3-mintbodyをHeLa細胞に発現させて、超解像度蛍光顕微鏡を用いてライブイメージングにより検出した。H3K9ac-mintbodyは細胞内安定性が十分ではなかったため、アミノ酸置換による改良を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度の遅れは取り戻すことができたが、その分2021年度に予定していた実験計画を後ろにずらす必要があったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
mintbodyプローブを用いて、ユークロマチンドメインおよびヘテロクロマチンドメインを可視化し、動態を解析する。
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