| 研究課題/領域番号 |
20K06515
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 東北大学 (2022)
国立研究開発法人理化学研究所 (2020-2021) |
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研究代表者 |
浜口 祐 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (00587876)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2021年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2020年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
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| キーワード | クライオ電子顕微鏡 / グルタミン酸輸送体 / テトラスパニン / 単粒子構造解析 / エクソソーム / グルタミン酸トランスポーター / 単粒子解析 / 膜タンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
神経変性疾患の原因因子の一つとされるグルタミン酸輸送体EAAC1および炎症性疾患やがんの成長・転移への関与が提唱されているテトラスパニンCD63について、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析を行い、疾患の発症・進展メカニズムの解明を目指す。これらのタンパク質は細胞膜に常在し、構造解析が難しいターゲットとされてきた。本研究では、構造解析が難しいとされているターゲットについての構造知見を提供する。
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| 研究成果の概要 |
エクソソームに局在する膜タンパク質であるグルタミン酸輸送体(EAAC1)およびテトラスパニン(CD63)についてヒト細胞を利用して組換えタンパク質として発現・精製を試みた．それぞれGFP融合タンパク質として発現させ，蛍光顕微鏡下においてその発現が確認できた．このとき，培地中にエクソソームとして分泌される様子も観察することができ，発現したタンパク質がエクソソームに正しく局在している可能性が示唆された．
得られたタンパク質をそれぞれクライオ電子顕微鏡で観察を試みたところ，EAAC1では目的タンパク質とみられる粒子像が得られた．
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| 研究成果の学術的意義や社会的意義 |
高発現系ヒト細胞(Expi293F)を用いて，EAAC1およびCD63の発現系の構築および組換えタンパク質の調製が可能であることが明らかとなった．EAAC1およびCD63はそれぞれ疾患との関りが強く，神経変性疾患やメラノーマで特異的に発現量が増えることが報告されている．このことから，これらの過剰発現細胞系がそれぞれの疾患のメカニズム解析へと貢献できる可能性を示唆している．
また，重金属を利用したネガティブ染色並びにクライオ電子顕微鏡像からEAAC1については粒子が均一な構造をとっており，単粒子構造解析が可能であることを示唆するデータが得られている．
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