| 研究課題/領域番号 |
20K06534
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | Caポンプ / リン酸化中間体 / クライオ電子顕微鏡 / エネルギー共役 / 一分子蛍光観察 / ポリアミン / パーキンソン病 / 脂質 / EP / ATP13A2 / P型ATPase / フリッパーゼ / カルシウムポンプ / P型ATPアーゼ / 蛍光ラベル / 1分子観察 / ヘリックス / グリシン / 脱共役 / 柔軟性 / 構造変化伝達 / 復帰突然変異 / 部位特異的変異 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究はP型ポンプのCaポンプ、フリッパーゼにおいて、ATPを加水分解する触媒部位と輸送部位の離れた部位間で「如何に構造変化が伝達されて共役が起こるか？」という未解決問題に答える。本研究は、Ca輸送の鍵となる「リン酸化中間体(EP)の異性化/Ca放出」過程の中間状態を筆者が捕捉したことを利用する。また、Caポンプで見出した構造因子の変異をフリッパーゼに応用する。さらにCaポンプで未解決であるCa放出前の2つのEP中間体アナログの原子構造を解明し、さらに新規変異の効果を解析する。着目した構造因子への変異の効果を上記2ポンプで比較し、その共通点/相違点からP型ポンプ共通の共役機構を解明する。
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| 研究成果の概要 |
CaポンプのEP異性化/Ca輸送では、細胞質側のAドメインが大きく回転して配置を変え、構造変化が遠く離れた輸送部位に伝達されCa放出する。Aドメインの特異的部位を蛍光ラベルして一分子蛍光観察し、EP分解過程でその動きをライブ検知し、E2PCa2相当の状態を経由することを示した。CaポンプM4のArg324側鎖が脂質頭部と反応段階に応じて結合相手を変える。この結合がEP異性化に重要な役割を持つ多機能性を示した。
フリッパーゼの類似酵素ATP13A2のクライオ電顕により中間体の原子構造を解明し、E2P加水分解・Pi遊離に伴なうポリアミン結合と輸送の構造変化、部位特異的変異から輸送機構を明らかにした。
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| 研究成果の学術的意義や社会的意義 |
CaポンプのEP異性化/Ca輸送；Ca2E1P → Ca2E2P → E2Pでは、Aドメインが駆動する細胞質領域の配置変化が伝達されCa放出する。Ca2E2Pの存在は未実証であった。Aドメインを蛍光ラベルし、その動きの観察から野生型CaポンプのEP異性化でCa2E2P状態をライブ検知した。CaポンプのArg324側鎖が反応段階に応じて脂質頭部と結合し、EP異性化に重要な役割を持つことを示した。ポリアミンを輸送するATP13A2はパーキンソン病の原因遺伝子PARK9である。輸送サイクルの各中間体のクライオ電顕構造を解明し、輸送機構を明らかにした。上記疾患の遺伝的な原因と治療法の探求に貢献する。
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