| 研究課題/領域番号 |
20K06538
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2020年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 卵成熟誘起ホルモン / 1-methyladenine / 1-メチルアデニン / 受容体 / GPCR / ケミカルジェネティクス / シグナル伝達 / イトマキヒトデ / 卵成熟 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
卵成熟誘起ホルモンは有性生殖に必須の卵子形成最終過程である卵成熟開始を制御する。1969年に全ての動物に先駆けヒトデのホルモンが分子として同定され、魚類や両生類、ほ乳類など脊椎動物を含む卵成熟研究発展への契機となった。国内外でホルモン受容体の同定が試みられ、これまで魚やカエルでの報告はあるものの、ヒトデでは今なお不明である。本研究の目的は、このヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体分子を同定することである。これまでケミカルジェネティクスという手法により見いだした受容体候補がヒトデ卵で機能する真の受容体であるのかを確かめ、卵成熟研究のさらなる進展を目指す。
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| 研究実績の概要 |
ヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体の同定が本研究の目的であり、申請者がこれまでに見いだした有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)がヒトデ卵で機能する真の受容体であるかどうか確認しようとしている。これまで卵で発現している候補GPCRの機能阻害を目指して、抗GPCR精製抗体による阻害や、機能不全型GPCR変異体の発現による競合的阻害を試してきた。
今年度は抗体による阻害について進展があり、細胞外突出部分を抗原とした精製抗体を海水中に加えて卵表層に作用させることで、約半数の卵の卵成熟を完全に阻害することに成功した。この阻害は抗原ペプチドを添加することで阻害がキャンセルされたことから、精製抗体溶液に含まれる夾雑物の影響などではなく抗体の作用を通じたものと結論された。ただし阻害率を上げようと繰り返し実験を行ったところ、卵のなかに阻害できる卵とそうでないものが存在することが判明した。これら阻害効果の違いは、ホルモンに応答するタンパク質のリン酸化状態の違いと相関があり、阻害効果が見られない卵ではホルモンに応答した後に見られるリン酸化が検出された。これは未成熟卵にはホルモンの作用を受けた状態の卵が存在することを示しており、ホルモンの作用機構には、一部の標的タンパク質が応答しているが未成熟の状態を維持する段階と、その後実際に卵成熟を誘起する２段階あると推測された。
性質が異なる未成熟卵の存在を示唆する報告はこれまでにも存在したが、今回のように細胞内のタンパク質のリン酸化状態の違いとして分子レベルで違いを示したのは初めてとなる。この知見はホルモンの作用機構の理解の手がかりとなり、今後の成熟誘起機構の解明に役立つと期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究開始当初のCOVID-19対策としての出校制限による研究の遅れについては、ややとり戻してきていた。また今年度は、抗体を用いた阻害実験に進展があり、有力候補が真の受容体である可能性が非常に高まっていた。しかし、さらに解析を進めるうちにホルモン受容体が、１種類で２段階の作用を担うこと、または２種類ある可能性が出てきてしまった。これは当初想定していなかった事実で、研究をまとめるためには、まずは１種類か２種類かの問題を解決する必要がある。１種類の受容体の場合はホルモン濃度によりシグナル伝達に違いが出るという作用機構に関する詳細が加わるだけだが、もし２種類ある場合は本研究目的遂行のためには現在の候補以外の受容体も探索する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
候補GPCRがヒトデ卵細胞内で卵生熟誘起ホルモンに応答する受容体であるかについては、細胞外突出部位に対する精製抗体による阻害により、その可能性が非常に高いことが示された。しかし、その解析の過程で、ホルモンの作用機構に２段階あり、この２段階の作用が、１種類の受容体が低濃度と高濃度で使い分けられている可能性と、２種類のホルモン受容体が存在する可能性とが考えられた。今後は、まずこの問題を解決する。候補GPCRを別の細胞内突出部位に対する抗体で阻害した時に、どちらの卵でも阻害できれば１種類であり、上記同様阻害がかかるものとそうでないものがある結果となれば２種類存在することになるため、この実験を優先して進める。今までのところ細胞内突出部位に対する抗体では卵成熟開始の遅れは見られたものの完全な阻害は出来ていなかったため、抗体を細胞表層へ標的化するタンパク質を抗体と同時に導入することにより、より効率的な阻害の実現を目指したい。
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