研究課題
基盤研究(C)
CRISPR/Cas9によるノックインは狙った遺伝子の自在な改変を可能にするが、Cas9標的部位やその他の部位の高頻度なランダム変異（Indels）を伴う。しかし申請者らは、Cas9 nickaseを用いたTandem Paired Nicking法（TPN法）によって従来と概ね同等のノックイン効率を維持しつつランダム変異を著減できることを示した。しかしTPN法のノックインがなぜ、どのように起きるのかは、その制御機構も含めて不明である。そこで本研究では、複数の内在性遺伝子を用いたアッセイ系などによって、同法のノックインがどのような行程で起きるのかを調べ、その分子機序を解析する。得られた知見を利用してノックイン効率の向上を目指し、臨床応用への道を開く。
Tandem Paired Nicking法（TPN法）は、当研究グループが数年来にわたって研究してきたCas9 nickaseを用いるノックインの手法である。通常のCas9 nucleaseを用いるノックインでは、ゲノムDNAに二重鎖切断が導入され、細胞の相同組換え修復機構が起動することによってドナーDNAとの相同性に基づく組換え（すなわちノックイン）が起きる。それに対し、TPN法では、2個のCas9 nickaseがゲノムDNA二重鎖のうちの同一の鎖に2個のニックを導入するが、DNA二重鎖切断は導入しない。一方、Cas9 nickaseの標的配列が相同領域内に設置されるため、ドナーDNAにもゲノムDNAと同所性のニックが導入される。すなわち2個のCas9 nickaseによって合計4個のニックが導入され、それによってゲノムDNAとドナーDNAの相同性に基づく組換えが起きる。このようなニック導入様式によって相同性に基づくDNA組換えが誘導される事例の報告は現在まで多くない。そのため、どのような分子メカニズムがこの組換えを駆動するのか、どのような実験条件がTPN法のノックイン効率を決定するのかなどが未解明のまま残されている。本研究では、このような疑問に対する解明の端緒を探るため、ゲノムDNA上の編集対象遺伝子におけるCas9 nickase標的配列の選定、ドナーDNAの設計・準備条件などについて検討を進める計画である。当研究グループでは、TPN法のノックイン効率を計測するための内在性遺伝子に基づくアッセイ系として、これまでヒトPIGA遺伝子（X染色体）を使用してきた。具体的には、ヒト男性由来の培養細胞株が持つPIGA遺伝子に点変異（不活化変異）をノックインし、これをTPN法で修復してその効率をフローサイトメトリーで計測する方法を採用してきた。本研究の初年度は、ヒト細胞株の内在性遺伝子に基づく別のアッセイ系の樹立を目標として、下記「現在までの進捗状況」に記載した通りの研究展開を行った。
3: やや遅れている
初年度の研究目標を達成するための具体策として、ヒト細胞株において、まず常染色体上にあるPIGP遺伝子の一方のアレルにキロベース単位の大規模欠失を導入し、続いて他方のアレルに点変異（不活化変異）を導入した。完成した細胞クローンに対してTPN法によるPIGP遺伝子修復を行い、その効率をフローサイトメトリーによって定量的に計測しうることを確認した。新型コロナウイルス感染拡大状況に起因する研究活動の制限、研究資材の調達の遅れなどのため、期待していた最大限の研究の進展は達成できなかった。しかしアッセイ系の樹立というひとつのサブテーマを完了することができた。
TPN法による高効率なノックインを達成しうるCas9 nickase標的の配列・位置に関する条件の検討、至適なドナーDNAの長さに関する詳細な検討、TPN法に必要な分子ツールを細胞内導入するときの実験的条件などについて検討を行う予定である。新型コロナウイルス感染拡大防止に十分に留意しつつ研究を推進する。
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Cell Death Discov
巻: -
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