| 研究課題/領域番号 |
20K06672
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44020:発生生物学関連
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| 研究機関 | 東邦大学 (2023)
上智大学 (2020-2022) |
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研究代表者 |
山田 葉子 東邦大学, 理学部, 教授 (80859695)
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| 研究分担者 |
川田 健文 東邦大学, 理学部, 教授 (30221899)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2020年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 細胞分化 / オートファジー / 細胞性粘菌 / 進化発生 / 胞子 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞性粘菌は飢餓ストレスを受けると細胞集合して多細胞となり発生・分化を行う。我々は細胞の飢餓応答であるオートファジーが、細胞性粘菌の細胞分化に特異的な役割を持つことを示し、分化を多様に調節する新規オートファジー制御因子KnkAを同定した。本研究ではKnkAとオートファジーによる分化調節の機構を解明するため、KnkA作用の分子解析や、オートファジーによる分化調節に働く情報伝達因子の分離と機能解析を行う。また進化系統の異なる細胞性粘菌種におけるオートファジーの役割についても検討することで、細胞性粘菌の系統間で見られる分化型多様化の分子基盤としてのオートファジーの役割の理解を目指す。
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| 研究実績の概要 |
細胞性粘菌では、細胞外cAMPがGタンパク質依存性膜受容体を介して、Gタンパク質非依存的に胞子分化を誘導する。誘導にはオートファジー活性が必須である。近傍ビオチン化法を用いて受容体に結合して誘導に働く分子を探索する目的で、これまでにcAMP受容体遺伝子に変異型BirAビオチンリガーゼTurboIDを挿入した株を作成し、cAMPに応答して特異的にビオチン化されるタンパク質をウエスタンブロットで検出した。昨年度はこれらのビオチン化タンパク質精製の条件検討を進め、プロトコールの至適化を行なった。
一方オートファジーと細胞分化におけるKnkAおよびBcas3機能の進化的変遷を明らかにする目的で、蛍光タンパク質で標識したマウス及びシロイヌナズナのknkA, bcas3オーソログをDdisにおける両遺伝子の欠損株に導入したところ、予想に反し表現型の相補が見られなかった。蛍光タンパク質による活性阻害でないことを確認するため、ペプチドタグに置き換えた発現用ベクターを作成した。細胞に導入し相補性を検討する。
また細胞性粘菌の系統間におけるKnkA, Bcas3の機能比較の目的で、Dictyostelium discoideum (Ddis)とは系統の異なるPolysphondilium violaceum (Pvio) においてknkA, bcas3 遺伝子破壊株を、P. pallidum (Ppal) においてknkA 遺伝子破壊株をこれまでに作成した。昨年度は表現型解析の一環として分化マーカー遺伝子導入株を作成し発現解析を進めた。
オートファジー関連因子を迅速にノックダウンする目的で大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR)をデグロンとしたシステムのDdisへの応用を試みたが、タグ付きマーカーの発現が観察されなかった。コンストラクトの再作成とオーキシン誘導デグロンタグの再実験を試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和２年度から4年度にかけてコロナウイルス感染症にともなう研究自粛、および研究代表者の機関異動に伴う研究の断続などにより進行が遅れていたが、令和5年度も代表者の再度の機関異動や、他業務の増加によって研究時間が限られたことなどから、進行の遅れを取り戻すことは困難であった。
その中で近傍ビオチン化法による情報分子の同定実験を進めたが、内在性のビオチン化タンパク質が非常に多く、目的因子の精製条件の至適化に予測した以上の時間を要した。
またPvio, Ppalにおける目的遺伝子の変異株作成と表現型解析を行なっているが、従来用いられてきたDdisとは異なり、特にPpalでは遺伝子導入の効率が極めて悪く、またいずれの種でも導入したマーカー遺伝子が非常に不安定であった。他業務による研究の断続と相まって解析が難航し、期待した進捗を得られなかった。
以上のような状況を総合的に判断し「やや遅れている」と結論した。
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| 今後の研究の推進方策 |
分化誘導に働くcAMPシグナルの情報経路について、近傍ビオチン化を利用したcAMP受容体結合タンパク質の解析を進める。これまでに精製プロトコールの適正化を行なった。近くマススペクトロメトリーを用いてcAMP特異的にビオチン化されるタンパク質の同定を行う予定である。同定されたタンパク質について、変異導入による機能解析、細胞内局在解析などを行う。
PvioおよびPpalにおけるknkA, bcas3遺伝子破壊株について、マーカー遺伝子発現など表現型のより詳細な解析を行い、発表を目指す。Ppal bcas3への変異導入はこれまで複数の方法で条件を検討しつつ試したが成功しておらず、ゲノム編集の条件検討を継続し、変異導入を引き続き試みる。Ddis遺伝子破壊株におけるマウスまたはアラビドプシスknkA, bcas3の発現株についても、表現型の解析を継続しまとめる。
また、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR)をデグロンを用いたオートファジー活性の任意調節についても、引き続き検討する。
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