| 研究課題/領域番号 |
20K07054
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
山田 剛 帝京大学, 付置研究所, 准教授 (80424331)
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| 研究分担者 |
鈴木 章一 帝京大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (40253695)
矢口 貴志 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (60361440)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2020年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 皮膚糸状菌 / 皮膚真菌症 / プロテアーゼ / 整体防御回避 / 生体防御回避 / 白癬 / 白癬菌 / 病態形成メカニズム |
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| 研究開始時の研究の概要 |
白癬菌の感染によって起こる白癬の病態形成メカニズムは今なお不明な点が多い。白癬菌は角質層内に侵入・増殖して病態を形成することから、本菌による白癬の病態形成メカニズムにおけるプロテアーゼの重要性が長らく議論されてきた。この点について、申請者は「白癬菌は多様なプロテアーゼを産生し、角質層を効率良く分解しながら生体内への侵入を進める一方、菌由来のプロテアーゼが宿主の生体防御機構を制御（抑制）するサプレッサーのような働きをすることで、宿主による排除の仕組みを巧みに逃れ、角質層内での持続的な発育を維持しているのではないか？」という１つの仮説を立てた。本研究を通じて、この仮説の検証を進める。
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| 研究実績の概要 |
白癬の原因菌である皮膚糸状菌（以下、白癬菌）が表皮角質層に侵入・増殖し、病態を形成するメカニズムに、本菌が産生する多様なプロテアーゼが密接に関与しているものと想像される。特に、細胞外に分泌されるプロテアーゼや細胞表面に局在するプロテアーゼの中には、角質層の効率的な分解と内部への侵入に深く関与しているものがあると考えられる。ところが、このようなプロテアーゼの中で角質層の効率的な分解と内部への侵入プロセスと関連があることが証明または示唆されたものは少なく、「白癬の病態形成メカニズムにおける菌由来の分泌型プロテアーゼの役割とは？」という問いに対する明確な答えは今なお得られていない。一方、我々は白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液が表皮ケラチノサイトに与える影響を解析し、「白癬菌由来のプロテアーゼが宿主の生体防御機構を制御（抑制）するサプレッサーのような働きをすることにより、角質層内での菌の持続的な発育を維持しているのではないか？”」という仮説を導き出した。白癬菌由来プロテアーゼに関する上記2つの疑問・仮説に対する知見を得るべく、研究を進めている。
令和4年度は、in vivo（動物感染モデル）とRNAseqを組み合わせた解析の結果、高レベルの発現が確認（報告）された白癬菌由来の10個の分泌型プロテアーゼの遺伝子を1個から全て欠損させた変異株で構成されるライブラリーを構成する各変異株を用いて、再構成ヒト培養表皮に対する感染形態の解析を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では、1. 白癬の病態形成メカニズムにおける白癬菌由来の分泌型プロテアーゼの役割に関する新たな知見を得る 2. 角質層内における白癬菌の持続的な発育維持のための菌由来プロテアーゼを介した宿主の生体防御機構の制御（抑制）の仕組み（プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能）の可能性に関する知見を得る、以上2つの目標を掲げ、菌が産生するプロテアーゼの解析を進めている。令和4年度は、in vivoで遺伝子の高発現が確認（報告）された10個の分泌型プロテアーゼを1個から全て欠損させた変異株の幾つかを用いて、再構成ヒト培養表皮に対する感染形態の解析を行なった。その結果、Sub6（ARB_05307）またはSub8（ARB_00777）を欠損させると、角層内への菌糸の侵入能力が低下することが判明した。また、Sub6を欠損させると、角層表面への胞子の接着能力が低下することが判明した（Sub8欠損株では、角層表面への胞子の接着能力の低下は認められなかった）。
一方、白癬菌由来プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能の可能性に関する知見を得るために令和4年度に計画していた「白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液による表皮ケラチノサイト（培養細胞）の細胞死の様式（ネクロシスまたはアポトーシス）を検証するための種々の解析（プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた解析、ELIZA法を用いた解析）」については、新型コロナウイルス感染症問題の影響で実施することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1年間の延長となった令和5年度は、「白癬の病態形成メカニズムにおける菌由来の分泌型プロテアーゼの役割の解明」に重点を置いた解析を進めて行く。特に、再構成ヒト培養表皮に対する分泌型プロテアーゼ欠損株の感染形態の解析を通じて、Sub6およびSub8が角層内への菌糸の侵入能力に何らかの影響を与えている可能性が示唆されたことから、これらのプロテアーゼ欠損株を中心に、①再構成ヒト培養表皮に対する感染形態 ②総プロテアーゼ活性 ③欠損させたプロテアーゼと関連のある他の遺伝子〔in vitroで高発現するプロテアーゼ遺伝子、プロテアーゼの産生制御に関わる転写因子など〕の発現量に対する影響など」の比較解析を進めていく。また、動物感染モデルを用いたin vivoの実験を実施し、病態の経時変化を比較解析する。
一方、「白癬菌由来プロテアーゼによる宿主の免疫応答回避機能の可能性」に関する知見を得るために昨年度に計画していた「白癬菌の菌糸から調製した細胞抽出液による表皮ケラチノサイト（培養細胞）の細胞死の様式（ネクロシスまたはアポトーシス）を検証するための種々の解析（プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた解析、ELIZA法を用いた解析）」を実施し、得られた解析結果に基づいて「表皮ケラチノサイトに誘導される細胞死の様式の解明、ならびに細胞死を誘導する分子（リガンド）及び細胞死を抑制する菌由来のプロテアーゼの解明」を目指す。
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