新しい遺伝子改変マウスを用いた脳神経小胞でのV-ATPaseの機能解析

• 研究課題/領域番号: 20K07243
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分48010:解剖学関連
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 青戸 一司 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60360476)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2022年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2020年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: てんかん性脳症 / ATP6V0A1 / V-ATPase / シナプス小胞 / 損傷リソソーム / CRISPR-Cas9ゲノム編集 / ヒト疾患モデルマウス / オートファジー異常 / リソソーム / 小児難治性てんかん原因遺伝子 / ATP6VA1 / 小胞（リソソーム・シナプス小胞 / Atp6v0a1-A512Pマウス / TetON3G-Creマウス / Atp6v0a1-floxマウス / Atp6v0a1-3xHAマウス / 小胞（リソソーム・シナプス小胞） / Atp6v0a1 / 脳神経の小胞（リソソーム・シナプス小胞） / GONAD法 / Vesicle-IP

研究開始時の研究の概要

最近、申請者らはてんかんの原因遺伝子として、プロトンポンプであるV-ATPaseの構成サブユニットの１つであるATP6VA1の p.A512P変異を見出した。培養細胞の解析から、V-ATPaseは、小胞（リソソーム・シナプス小胞）で発現し、小胞内のpH調節、細胞死制御、オートファジー、mTorシグナル制御などに関与することが明らかになっているが、有用なマウスモデルがないため、脳神経でのV-ATPaseの機能は十分にわかっていない。本研究では、以下の3つの変異マウスを用いた解析によって、脳神経の小胞におけるV-ATPaseの生理的役割、及び、小胞の形成・維持に関与する分子群を明らかにする。

研究成果の概要

てんかん性脳症の原因遺伝子として、細胞内小胞（小胞体、シナプス小胞、リソソーム）の膜に発現し、プロトンポンプであるV-ATPaseの構成サブユニットの１つであるATP6V0A1の４変異を見出した。これらA512PとR741Q変異マウス及びノックアウトマウスを作製して解析を行い、リソソームのpH調節、細胞死制御、オートファジー、mTORシグナル制御などに関与することを明らかにした。

研究成果の学術的意義や社会的意義

てんかんは最も頻度が高い神経疾患の一つで、日本国内に人口の1%近くの約100万人の患者がいると推定される。本研究は、リソソームの膜タンパク質ATP6V0A1の変異が発達性およびてんかん性脳症と関与していることを世界で初めて明らかにした。本研究の成果は、小児難治性てんかんの病態解明に貢献し、ゲノム編集で作製した疾患モデルマウスは効果的な治療法の開発に寄与することが期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Cnpy3 mice reveal neuronal expression of Cnpy3 in the brain (2023)
  • 著者名/発表者名: Islam Md. Monirul、Mutoh Hiroki、Aoto Kazushi、Belal Hazrat、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience Methods 巻: 383 ページ: 109730-109730
  • DOI: 10.1016/j.jneumeth.2022.109730
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of Flag/DYKDDDDK Epitope Tag Knock-In Mice Using i-GONAD Enables Detection of Endogenous CaMKIIα and β Proteins (2022)
  • 著者名/発表者名: Aoto Kazushi、Takabayashi Shuji、Mutoh Hiroki、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 号: 19 ページ: 11915-11915
  • DOI: 10.3390/ijms231911915
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Successful i-GONAD in Mice at Early Zygote Stage through In Vivo Electroporation Three Min after Intraoviductal Instillation of CRISPR-Ribonucleoprotein (2022)
  • 著者名/発表者名: Shuji Takabayashi, Kenta Iijima, Masumi Tsujimura, Takuya Aoshima, Hisayoshi Takagi, Kazushi Aoto and Masahiro Sato
  • 雑誌名: Int. J. Mol. Sci. 巻: 23(18) 号: 18 ページ: 10678-10678
  • DOI: 10.3390/ijms231810678
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genome sequencing and RNA sequencing of urinary cells reveal an intronic FBN1 variant causing aberrant splicing (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiraide Takuya、Shimizu Kenji、Miyamoto Sachiko、Aoto Kazushi、Nakashima Mitsuko、Yamaguchi Tomomi、Kosho Tomoki、Ogata Tsutomu、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: - 号: 7 ページ: 387-392
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01016-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Elucidation of pathological mechanism caused by human disease mutation in CaMKIIβ (2022)
  • 著者名/発表者名: Mutoh H, Aoto K, Miyazaki T, Fukuda A, Saitsu H.
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience Research 巻: 100 号: 3 ページ: 880-896
  • DOI: 10.1002/jnr.25013
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A novel de novo TMEM63A variant in a patient with severe hypomyelination and global developmental delay (2022)
  • 著者名/発表者名: Fukumura Shinobu、Hiraide Takuya、Yamamoto Akiyo、Tsuchida Kousuke、Aoto Kazushi、Nakashima Mitsuko、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Brain and Development 巻: 44 号: 2 ページ: 178-183
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2021.09.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H(+)-ATPases is essential for brain development in humans and mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N and Saitsu H
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 12 号: 1 ページ: 2107-2107
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22389-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cell lineage‐ and expression‐based inference of the roles of forkhead box transcription factor Foxc2 in craniofacial development (2021)
  • 著者名/発表者名: Takenoshita Manami、Takechi Masaki、Vu Hoang Tri、Furutera Toshiko、Akagawa Chisaki、Namangkalakul Worachat、Aoto Kazushi、Kume Tsutomu、Miyashin Michiyo、Iwamoto Tsutomu、Iseki Sachiko
  • 雑誌名: Developmental Dynamics 巻: - 号: 8 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1002/dvdy.324
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A boy with biallelic frameshift variants in TTC5 and brain malformation resembling tubulinopathies (2021)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto Sachiko、Kato Mitsuhiro、Sugiyama Kenji、Horiguchi Ryo、Nakashima Mitsuko、Aoto Kazushi、Mutoh Hiroki、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 66 号: 12 ページ: 1189-1192
  • DOI: 10.1038/s10038-021-00953-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Parthenogenetic mosaicism: generation via second polar body retention and unmasking of a likely causative PER2 variant for hypersomnia (2021)
  • 著者名/発表者名: Masunaga Yohei、Kagami Masayo、Kato Fumiko、Usui Takeshi、Yonemoto Takako、Mishima Kazuo、Fukami Maki、Aoto Kazushi、Saitsu Hirotomo、Ogata Tsutomu
  • 雑誌名: Clinical Epigenetics 巻: 13 号: 1 ページ: 73-73
  • DOI: 10.1186/s13148-021-01062-0
  • NAID: 120007042184
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nanopore sequencing reveals a structural alteration of mirror‐image duplicated genes in a genome‐editing mouse line (2019)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto Sachiko、Aoto Kazushi、Hiraide Takuya、Nakashima Mitsuko、Takabayashi Shuji、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Congenital Anomalies 巻: - 号: 4 ページ: 120-125
  • DOI: 10.1111/cga.12364
  • NAID: 210000157792
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 簡便なi-GONAD法によるFlag（DYKDDDDK）タグを挿入したマウスの作製とその有用性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 青戸一司、高林秀次、武藤弘樹、才津浩智
  • 学会等名: 128回日本解剖学会総会・全国学術総会
• [図書] 生体の科学、特集リソソーム研究の新展開、Ⅲリソソームと疾患、損傷リソソームとてんかん (2022)
  • 著者名/発表者名: 青戸一司、才津浩智
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 医学書院