インスリン様成長因子等による側鎖型オキシステロール産生調節を介した新規情報伝達

• 研究課題/領域番号: 20K07314
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分48040:医化学関連
• 研究機関: 獨協医科大学
• 研究代表者: 杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
• 研究分担者: 安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: Cyp46A1 / Fetuin-B / Neuroblastoma / IGF-II / オキシステロール / Cytochrome P450 46a1 / 24S-ヒドロキシコレステロール / NIH3T3細胞 / T98G細胞 / N2A細胞 / シトクロムP450 46A1 / コレステロール25-ヒドロキシラーゼ / シトクロム P400 46a1 / コレステロールヒドロキシラーゼ / インスリン様成長因子 / グルカゴン / 酸化コレステロール

研究開始時の研究の概要

コレステロールは炭化水素鎖が酵素によりヒドロキシル化を受けると生理活性を有する側鎖型オキシステロールに代謝される。側鎖型オキシステロール25-hydroxycholesterol(25-HC)の産生酵素cholesterol 25-hydroxylase(Ch25h)の転写や酵素活性がfetal bovine serum(FBS)添加により抑制され、FBS中の本転写抑制因子がインスリン様成長因子-II(IGF-II)であることをつきとめた。本研究の目的は、インスリン様成長因子等によるシグナル伝達において、側鎖型オキシステロールの関与を解明することである。

研究実績の概要

細胞はコレステロールをCyp46A1 により24-ヒドロキシコレステロール(オキシステロール)として細胞外に排出する。NIH3T3細胞のCyp46A1 mRNA量はFBS添加により抑制される。そこでNIH3T3細胞を用いてFBS中に存在するCyp46A1 mRNA量を抑制する因子の同定を行った。FBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析した。その結果抑制因子はIGF-IIであることが明らかとなった。同じ方法でヒト由来Neuroblastoma細胞(T98G細胞)を用いてIGF-IIのCyp46A1 mRNAへの影響をみたところNIH3T3細胞と異なり抑制効果はなかった。そこでT98G細胞を48時間スターブ状態で培養しFBSを添加したところCyp46A1 mRNA量は顕著に抑制されたことから、T98G細胞においてFBS中にはCyp46A1 mRNAを低下させるIGF-IIとは別の因子が存在すると考えた。T98G細胞を用いてFBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析したところ、Fetuin-Bが候補となった。市販の大腸菌高発現Fetuin-Bでも血液からの精製Fetuin-BでもCyp46A1 mRNA量抑制作用が認められた。現在、T98G細胞にFetuin-Bを添加し、Cyp46A1のwestern blotや質量分析装置を用いた各種オキシステロールの細胞内濃度変化を解析し、細胞レベルでのFetuin-Bの作用を解析中である。マウスにFetuin-B高発現プラスミドを静注しin vivoレベルでのFetuin-Bの作用を解析中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

NIH3T3細胞を用いてFBS中に存在するCyp46A1 mRNA量を抑制する因子の同定を行った。FBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析した。その結果抑制因子はIGF-IIであることが明らかとなった。同じ方法でヒト由来Neuroblastoma細胞(T98G細胞)を用いてIGF-IIのCyp46A1 mRNAへの影響をみたところNIH3T3細胞と異なり抑制効果はなかった。そこでT98G細胞を48時間スターブ状態で培養しFBSを添加したところCyp46A1 mRNA量は顕著に抑制されたことから、T98G細胞においてFBS中にはCyp46A1 mRNAを低下させるIGF-IIとは別の因子が存在すると考えた。T98G細胞を用いてFBS をクロメタ抽出し脂質相と水相に分け効果をみたところ水相に転写抑制因子が存在することを突き止めた。FBSの水相由来の画分をHPLCで分画しCyp46A1 mRNAを低下させる分画を部分精製し質量分析装置で解析したところ、Fetuin-Bが候補となった。市販の大腸菌高発現Fetuin-Bでも血液からの精製Fetuin-BでもCyp46A1 mRNA量抑制作用が認められた。また、Fetuin-B高発現プラスミドをマウスに投与し、Fetuin-Bの効果をin vivoで解析している。

今後の研究の推進方策

T98G細胞にFetuin-Bを添加し、Cyp46A1のwestern blotや質量分析装置を用いた各種オキシステロールの細胞内濃度変化を解析する。他のNeuroblastoma細胞を用いてT98G細胞と同じ効果があるか否か解析する。Fetuin-B高発現プラスミドをマウスに投与し、Fetuin-Bが高発現しているマウスの作成に成功した。このマウスを用いてin vivoでのFetuin-Bの作用を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Transcription of cytochrome P450 46A1 in NIH3T3 cells is negatively regulated by FBS (2022)
  • 著者名/発表者名: Shinohara Y, Ando H, Maekawa M, Arai M, Horibata Y, Satou M, Jojima T, Usui I, Aso Y, Sugimoto H.
  • 雑誌名: Biochim Biopys Acta Mol Cell Biol Lipids 巻: 1867(6) 号: 6 ページ: 159136-159136
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2022.159136
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The zonula occludens protein family regulates the hepatic barrier system in the murine liver (2021)
  • 著者名/発表者名: Masahiko Itoh, Misao Terada, Hiroyuki Sugimoto
  • 雑誌名: BBA - Molecular Basis of Disease 巻: 1867(1) 号: 1 ページ: 165994-165994
  • DOI: 10.1016/j.bbadis.2020.165994
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The phosphatidylcholine transfer protein StarD7 is important for myogenic differentiation in mouse myoblast C2C12 cells and human primary skeletal myoblasts. (2020)
  • 著者名/発表者名: Horibata Y, Mitsuhashi S, Shimizu H, Maejima S, Sakamoto H, Aoyama C, Ando H, Sugimoto H
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 号: 1 ページ: 2845-2845
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59444-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Imaging of lysophosphatidylcholine in an induced pluripotent stem cell-derived endothelial cell network (2020)
  • 著者名/発表者名: Shimizu Yasuo、Nakamura Yusuke、Horibata Yasuhiro、Fujimaki Mio、Hayashi Keitaro、Uchida Nobuhiko、Morita Hiroko、Arai Ryo、Chibana Kazuyuki、Takemasa Akihiro、Sugimoto Hiroyuki
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 14 ページ: 299-305
  • DOI: 10.1016/j.reth.2020.03.007
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Locations and contributions of the phosphotransferases EPT1 and CEPT1 to the biosynthesis of ethanolamine phospholipids. (2020)
  • 著者名/発表者名: Horibata Y, Ando H, Sugimoto H.
  • 雑誌名: Journal of Lipid Research 巻: 61 号: 8 ページ: 1221-1231
  • DOI: 10.1194/jlr.ra120000898
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] L-type amino acid transporter 1, LAT1, in growth hormone-producing pituitary tumor cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Satou Motoyasu、Wang Jason、Nakano-Tateno Tae、Teramachi Mariko、Suzuki Tokiko、Hayashi Keitaro、Lamothe Shawn、Hao Yubin、Kurata Harley、Sugimoto Hiroyuki、Chik Constance、Tateno Toru
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Endocrinology 巻: 515 ページ: 110868-110868
  • DOI: 10.1016/j.mce.2020.110868
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] リン脂質・コレステロールのオキシステロールによる合成制御に関与する転写因子とその機構解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 安戸博美、堀端康博、杉本博之
  • 学会等名: 分子生物学会
• [学会発表] オキシステロール産生酵素(コレステロール25-ヒドロキシラーゼ)の インスリン様成長因子による転写制御 (2020)
  • 著者名/発表者名: 篠原安武1,2、安戸博美1、堀端康博1、前川正充3、杉本博之1
  • 学会等名: 脂質生化学会
• [学会発表] 細胞膜リン脂質・コレステロールのオキシステロールによる合成制御機構 (2020)
  • 著者名/発表者名: 安戸博美、堀端康博、杉本博之
  • 学会等名: 生化学会
• [学会発表] リン脂質輸送タンパク質StarD7がミトコンドリアにおいて果たす役割 (2020)
  • 著者名/発表者名: 堀端康博、杉本博之
  • 学会等名: 脂質生化学会