研究課題/領域番号 |
20K07331
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分48040:医化学関連
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研究機関 | 関西医科大学 |
研究代表者 |
近藤 直幸 関西医科大学, 医学部, 講師 (30570840)
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研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
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キーワード | インテグリン / 小胞輸送 / LFA-1 / inside-out / outside-in / 超解像イメージング / 全反射顕微鏡 / 一分子計測 / 質量分析 / ウイルス / 細胞外小胞 |
研究開始時の研究の概要 |
インテグリン (ITG) は生体内における細胞の接着・動態を司る.細胞接着面でのITG制御機構は長年謎であった. 申請者は接着面でのリガンド結合の一分子計測に世界で初めて成功し, 一過性のITG-リガンド結合の繰り返しが接着を制御することを見出した.一方, 結合の素早いON/OFFの制御機構は不明であった.本研究ではITGを含有小胞の膜輸送/取込/排出のバランスを統御する制御因子の働きがITG機能を時空間的に制御するという仮説の基に, 新規ITG小胞含有因子の同定と高速撮像手法を用いた動態解析を進め, 接着制御/小胞排出の制御機構の全容解明と, その知識の臨床応用への橋渡しを目指す.
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研究実績の概要 |
本研究課題では, リンパ球の活性化やホーミングの過程において細胞間接着を介して重要な働きを担う接着分子である白血球インテグリンLFA-1を含む小胞の生成・輸送過程に注目し,その制御機構の解明を目指して実験を進めている。本年度は、前年度までに確立したスピニングディスク型超解像共焦点顕微鏡Dragonflyを用いたイメージング手法を用いて、様々な因子との共局在を超解像レベルで解析し、LFA-1の輸送に関わる因子をいくつか同定した。 前年度までの解析からLFA-1のリガンドであるICAM-1の結合依存的に誘導されるシグナル (outside-in シグナル)依存的にLFA-1細胞内小胞が顕著に形成されることをLFA-1に融合させたSNAPtagを生きた細胞内で共有結合により蛍光標識して可視化することにより明らかにしていた。 リンパ球にoutside-inシグナルをICAM-1やLFA-1の活性型構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて導入した後にパラホルムアルデヒドで固定しLFA-1含有小胞に局在する分子を蛍光免疫染色により調べたところ、この小胞にはRab7やRab8が特異的に共局在した。CRISPR-Cas9法を用いてRab7やRab8が欠損したリンパ球を作製し、その細胞接着能を調べたところ、接着能は野生型と比べて有意に低下した。さらに、細胞接着面におけるLFA-1の集積度合をLFA-1の機能に影響を与えない抗LFA-1抗体を用いて評価したところ、Rab7やRab8欠損リンパ球では集積が顕著に低下していることが明らかになった。以上の結果からRab7やRab8はoutside-in刺激依存的にLFA-1の接着面への輸送を制御する新規の因子であることが示唆された。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
LFA-1小胞輸送における新規の制御因子の同定に成功し、その制御機構の一端を明らかにすることができたため。
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今後の研究の推進方策 |
時空間的な制御の詳細を解明する目的で、本研究で同定された小胞輸送関連因子とLFA-1含有小胞を同時に可視化する実験系の確立を目指し、どのようにしてLFA-1がこれらの因子により輸送されているのかを明らかにする。Dragonflyを用いた二波長同時測定系は現在確立を進め、おおむね良好な結果が得られている。 また、これらの因子に対する初期培養細胞におけるノックアウト手法の確立やノックアウトマウスの取得、SNAPtagをLFA-1のC末端にノックインしたマウスの作製も進め、初期培養細胞においても、同定した小胞輸送関連因子群の重要性を調べる予定である。 これに並行して、使用の目途がついたため、質量分析を用いたLFA-1含有小胞の新規制御因子の網羅的な同定も感度のよい新型質量分析機器を使用して進め、LFA-1含有小胞輸送制御の包括的な理解を目指す。
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