がん細胞の複製ストレスを解消する新規lncRNAの機能解明

• 研究課題/領域番号: 20K07570
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分50010:腫瘍生物学関連
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 鈴木 美穂 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80548470)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 長鎖非翻訳RNA / がん細胞 / 複製ストレス / R-loop / DNA複製ストレス

研究開始時の研究の概要

がん細胞に特徴的な高い複製ストレスは、ゲノム不安定性をもたらし、発がんの促進やがんの進展を加速させることがよく知られている。しかし、がん細胞が高い複製ストレスに晒されながらも、複製を完了させ細胞増殖していく機構は完全に解明されていない。本研究では、①がん細胞の複製ストレスの解消に関わる新規lncRNAの同定 ②lncRNAと相互作用するタンパク質の同定から、未知のがん細胞複製ストレス解消メカニズムを明らかにする。

研究実績の概要

がん細胞に特徴的な高い複製ストレスは、ゲノム不安定性をもたらし、発がんの促進やがんの進展を加速させることがよく知られている。しかし、がん細胞が高い複製ストレスに晒されながらも、複製を完了させ細胞増殖していく機構は完全に解明されていない。私たちはこれまでに、複製ストレスによって発現が誘導される長鎖非翻訳RNA (lncRNA)、TUG1を同定した。タンパク質をコードしないlncRNAは近年DNA損傷修復との関連が報告されているが、私たちはTUG1がDNA損傷の原因となるR-loopを解消する役割をもつことを明らかにした。TUG1と相互作用しDNAの複製ストレスから生じるDNA損傷を防ぐ機能をもつタンパク質を解析したところ、R-loopに結合することが知られているDHX9が同定された。私たちは、DHX9とTUG1が細胞内で直接結合していることを実験的に示した。次に、TUG1が解消するR-loopをゲノムワイドに同定したところ、TUG1ノックダウンにより特異的にR-loopが蓄積する領域が約300ヶ所存在することが分かった。TUG1-sensitive sitesと名付けたこれらの領域は、数kbにわたってマイクロサテライト配列を含む特徴的なリピート配列であり、定常状態でもR-loopを蓄積しやすい領域であった。つまり、TUG1はR-loopを形成しやすくDNA損傷を受けやすい領域を標的とし、その領域のR-loopを解消することでゲノムDNAを損傷から守る機能を果たしていることがわかった。さらに私たちは、TUG1によるR-loop解消は、TUG1結合タンパク質DHX9のRNAヘリカーゼ活性によることを明らかにした。また、超解像顕微鏡によって、TUG1が標的とするR-loopは転写と複製が逆方向から衝突するDNA損傷を受けやすい領域であることを示した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

TUG1が解消するR-loopをゲノムワイドに同定するために、R-loopに特異的な抗体S9.6を用いてDRIP-seqを行った。解析の結果、TUG1ノックダウンにより特異的にR-loopが蓄積する領域が約３００ヶ所存在することが分かった。TUG1-sensitive sitesと名付けたこれらの領域は、数kbにわたってマイクロサテライト配列を含む特徴的なリピート配列であり、定常状態でもR-loopを蓄積しやすい領域であった。つまり、TUG1はR-loopを形成しやすくDNA損傷を受けやすい領域を標的とし、その領域のR-loopを解消することでゲノムDNAを損傷から守る機能を果たしていることがわかった。これまでの研究で、CRISPR技術を利用して目的のRNAに結合するタンパク質を生細胞内で同定するCRISPR-assisted RNA-protein interaction detection method (CAPID)法を行い、TUG1と結合するRNAヘリカーゼDHX9を同定している。TUG1-sensitive sitesにはTUG1とDHX9が結合しており、DHX9をノックダウンするとTUG1-sensitive sitesのR-loop量は増加する。これはDHX9の強制発現によってレスキューできるが、ヘリカーゼ活性変異体ではレスキューされなかった。このことから、TUG1によるR-loop解消は、TUG1結合タンパク質DHX9のRNAヘリカーゼ活性によることが明らかになった。
また、超解像顕微鏡によって、TUG1とR-loopとPCNAが共局在していることを示した。TUG1が標的とするR-loopは転写と複製が逆方向から衝突するtranscription-replication conflictsと呼ばれる領域であることが示唆された。

今後の研究の推進方策

本年度はTUG1を標的とする治療の効果を調べるため、脳腫瘍同所移植モデルを用いた動物実験を行う。R-loopを蓄積する抗がん剤との併用効果を含め、TUG1の発現抑制がどの程度腫瘍の増殖を抑えるか検討する。また、治療後の組織におけるTUG1発現量とR-loop量を調べ、TUG1阻害による細胞増殖抑制メカニズムについて解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Long non-coding RNA lnc-CHAF1B-3 promotes renal interstitial fibrosis by regulating EMT-related genes in renal proximal tubular cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Imai Kentaro、Ishimoto Takuji、Doke Tomohito、Tsuboi Toshiki、Watanabe Yu、Katsushima Keisuke、Suzuki Miho、Oishi Hideto、Furuhashi Kazuhiro、Ito Yasuhiko、Kondo Yutaka、Maruyama Shoichi
  • 雑誌名: Molecular Therapy - Nucleic Acids 巻: 31 ページ: 139-150
  • DOI: 10.1016/j.omtn.2022.12.011
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cancer-Specific Targeting of Taurine-Upregulated Gene 1 Enhances the Effects of Chemotherapy in Pancreatic Cancer (2021)
  • 著者名/発表者名: Tasaki Y, Suzuki M, Katsushima K, Shinjo K, Iijima K, Murofushi Y, Naiki-Ito A, Hayashi K, Qiu C, Takahashi A, Tanaka Y, Kawaguchi T, Sugawara M, Kataoka T, Naito M, Miyata K, Kataoka K, Noda T, Gao W, Kataoka H, Takahashi S, Kimura K, Kondo Y.
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: - 号: 7 ページ: 1654-1666
  • DOI: 10.1158/0008-5472.can-20-3021
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Maintenance of genome stability in cancer cells by long noncoding RNA (2022)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第8１回日本癌学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] R-loop調節における長鎖非翻訳RNATUG1の機能 (2022)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第１５回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] 長鎖非翻訳RNA TUG1 はR-loopを解消しがん細胞の増殖を促進する (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第80回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 長鎖非翻訳RNA TUG1 はR-loopを解消しがん細胞の増殖を促進する (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第49回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 長鎖非翻訳RNA TUG1は核スペックル近傍で複製フォークを保護する (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第１４回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Spatiotemporal regulation of long non-coding RNA to propagate Cancer Cells (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第126回日本解剖学会総会・全国学術集会 / 第98回日本生理学会大会合同大会
  • 招待講演
• [学会発表] Spatiotemporal regulation of replication stress by TUG1 as a prerequisite for cancer cell proliferation (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 長鎖非翻訳RNA TUG1による時空間的DNA複製ストレス制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美穂
  • 学会等名: 日本環境変異原学会第49回大会
  • 招待講演