| 研究課題/領域番号 |
20K07588
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分50010:腫瘍生物学関連
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
赤塚 慎也 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (40437223)
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| 研究分担者 |
豊國 伸哉 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (90252460)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 発がん / ゲノム解析 / 次世代シークエンシング / DNA傷害 / DNA修復 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、DNA損傷のゲノム内分布動態を確定するための方法として次世代シークエンサーを用いた新たな解析法を確立し、発がん刺激によるDNA損傷分布の変化とその意義を明らかにすることを目的とする。DNA損傷は遺伝子変異の原因となるため、そのゲノム内での分布動態を知ることは、がんの発生経路を確定し、予防の方策を講ずるうえで重要となる。本研究では、損傷DNAに対する免疫沈降産物の網羅的解析を次世代シークエンサーの新たな応用技術として確立し、発がん過程におけるDNA損傷のゲノム分布動態を解明する。さらに、その際の変異の発生頻度を評価することにより、DNA損傷分布変化の発がんにおける意義を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
細胞内で生じる活性酸素種等によるゲノムDNAの損傷は、発がんの原因になると考えられている。したがって、がんの発生経路を詳細に解析するためには、発がんの過程にある細胞のゲノム内におけるDNA損傷の分布動態を知ることが重要となる。本研究では、損傷DNAに対する免疫沈降産物の網羅的解析を次世代シークエンシングに基づく新たなアプリケーションとして確立し、発がん過程におけるDNA損傷のゲノム分布動態を解明することを目的とした。さらに、その際の変異の発生頻度を評価することにより、DNA損傷分布動態の発がんにおける意義を明らかにすることを試みた。
鉄ニトリロ三酢酸誘発げっ歯類発がんモデルを用い、その標的臓器となる腎臓の組織細胞より抽出したゲノムDNAについて抗8-オキソグアニン抗体を用いて免疫沈降を実施し、酸化的DNA損傷のゲノム内分布解析を行った。動物実験としては、野生型およびOGG1欠損型のC57BL/6マウスを用いた。OGG1は、ゲノムDNA中に生じた8-オキソグアニンの修復に必須の酵素である。無処置および鉄ニトリロ三酢酸投与後3時間の検体より抽出したゲノムDNAを、制限酵素で処理した後、免疫沈降によって8-オキソグアニン含有断片を分離・回収した。シークエンス解析は、ChIP-seq解析の方法に準じて実施し、マウス染色体上に8-オキソグアニン検出頻度としてマップした。
シークエンス解析の結果としては、ゲノム染色体にそった広領域間での8-オキソグアニン頻度のばらつきが見られた。これは、以前に行われたマイクロアレイによる解析結果とよく一致するものであり、現象の再現性をより精度の高い異なる技術的方法によって検証することができた。また、今回OGG1欠損状態での8-オキソグアニンのゲノム分布データを、新たに追加することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究課題の研究期間の３年間は、新型コロナ流行期に当たり、研究活動における様々な支障や教育業務の増加があり、課題推進に影響を受けた。また、関連研究の新しい報告に対応して実験原理の再評価と見直しの工程が加わったことにより、次世代シークエンシングによる解析の実施時期が後ろへずれ込むことになり、全体に若干の遅れが残った。具体的な進捗内容としては、本年度において、次世代シークエンサーによる、8-オキソグアニン含有ゲノム断片のシークエンス解析を実現した。当初の主たる課題である実験を実施し、解析の基となるデータが得られた。現状の解析としては、標準的なChIP-seq解析の出力を分析し、ゲノム染色体にそった広領域間での8-オキソグアニン頻度の変動を認めた。これは、以前に実施したマイクロアレイによる解析結果とよく一致するものであり、現象の再現性が新たな技術的方法によって検証された。また今回、OGG1欠損状態での8-オキソグアニンのゲノム分布データが、新たに追加された。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題の研究期間の３年間は、新型コロナ流行期に当たり、研究活動における様々な支障や教育業務の増加があり、課題推進に影響を受けた。また、関連研究の新しい報告に対応して実験原理の再評価と見直しの工程が加わったことにより、次世代シークエンシングによる解析の実施時期が後ろへずれ込むことになった。このため未完了の課題項目が残り、一部費用を次年度へ持ち越している。１年の期間延長での、残りの課題項目とその実施計画は整理されている。本年度に得られた（ChIP-seq解析に基づく）シークエンスデータの詳細分析を実施する。現状の解析としては、標準的なChIP-seq解析の出力（BigWig形式データ）を分析し、ゲノム染色体にそった広領域間での8-オキソグアニン頻度の変動を認め、以前のマイクロアレイによる解析結果との一致を確認した。現状の解析方法では、鉄ニトリロ三酢酸投与有無や、OGG1遺伝子欠損の有無による8-オキソグアニン分布の差異は小さく、サンプルの条件による分布変動の実態は明らかになっていない。ゲノム染色体にそった、より高い解像度での分析が必要であり、統計的検定の方法を含めて検討し、新たな生物学的発見につなげて行く。
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