| 研究課題/領域番号 |
20K07741
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分51030:病態神経科学関連
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
野中 里紗 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (90614248)
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| 研究分担者 |
志賀 孝宏 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (50784378)
石川 景一 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90733973)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 血液脳関門 / iPS細胞 / 内皮細胞 / ペリサイト / 神経変性疾患 / ヒト人工多能性幹細胞 / 細胞分化誘導 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
血液脳関門は、血液と中枢神経系との間の物質交換を制限するバリア機能を果たしている。パーキンソン病などの難治性神経変性疾患において、このバリア機能の破綻が疾患発症と強く関連するという報告がされている。更に、この血液脳関門の透過性は、中枢神経疾患の候補薬剤の効果を決定する重要な因子である。本研究は、神経変性疾患患者から樹立したiPS細胞を用いて、血液脳関門細胞モデルを確立・解析し、疾患における血液脳関門機能の破綻機構の解明や新たな治療標的を見出す事を目指す。
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| 研究実績の概要 |
血液脳関門（blood-brain barrier: BBB）は血液と中枢神経系との間の物質交換を制限するバリア機構であり、パーキンソン病などの難治性神経変性疾患の疾患発症に血液脳関門の破綻が関連するという知見が報告されている。本研究は、健常者ならびに神経変性疾患患者由来iPS細胞から分化誘導したBBB関連細胞を用いて、血液脳関門細胞モデルを確立・解析することを目的としたものである。
本年度は、健常由来および疾患由来のiPS細胞から分化誘導した内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、神経細胞の各細胞特性の解析を行うことを予定していた。iPS細胞から内皮細胞への分化誘導は、これまでに複数の健常由来iPS細胞およびパーキンソン病疾患由来iPS細胞から分化誘導を行い、それらの株において、内皮細胞特異マーカーの発現を指標に内皮細胞分化を確認することが出来ている。ペリサイトへの分化誘導においても、健常由来iPS細胞およびパーキンソン病の疾患由来iPS細胞の複数株においても、ペリサイト特異マーカーの発現を確認することができている。また、iPS細胞からアストロサイトへの分化誘導は、培養期間の短縮に加え、誘導効率の改良を行っており、高効率にアストロサイトへの分化誘導が可能になっている。iPS細胞から神経細胞への分化誘導は、その誘導効率および特性についても解析を行っており、疾患領域特異の神経細胞への分化誘導が高効率に可能である。現在は、BBB関連細胞を用いた共培養モデルの構築に向けて検討を進めており、各種細胞の細胞間相互作用の解析を行うのと並行し、バリア機能や細胞透過性の評価等を行う予定でいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、昨年度に引き続き、血液脳関門を構成する主な細胞である内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、神経細胞を健常・疾患由来iPS細胞から分化誘導を行い、細胞特性解析を中心に検討を行う予定であった。複数の健常由来iPS細胞および疾患由来iPS細胞から内皮細胞およびペリサイトへ分化誘導することができ、蛍光免疫染色にて内皮細胞マーカーの発現を指標に定性確認が可能であった。現在は、健常由来iPS細胞および疾患由来のiPS細胞から分化誘導した内皮細胞およびペリサイトの比較検討を進めている。また、iPS細胞からのアストロサイトへの分化誘導法も引き続き解析・検討を進めている。iPS細胞から神経細胞への分化誘導法は既に確立しており、疾患領域特異性を持った神経細胞を誘導することが可能である。共培養モデルの構築にあたり、誘導日数の違いが問題点の一つであるため、分化誘導日数の長い神経細胞を用いて、その前駆細胞での維持が可能であるか検討を行ったところ、本研究で使用している神経細胞分化誘導法は、神経幹細胞（神経前駆細胞）の段階で継代維持が可能であるが、長期に複数回継代を繰り返し行っても、領域特異性や神経幹細胞特性が維持されること、神経細胞への誘導効率にも影響がないという結果が得られている。しかし、昨年度に各種分化細胞を用いたtrans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価および細胞透過性の評価、トランスポーター、P糖タンパクの発現の検証・評価を予定していたが、現在、検討を進めているが評価までは至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
2024年度は、ひきつづき健常由来および疾患由来iPS細胞から内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト、神経細胞の分化誘導した細胞を用いて、それぞれの細胞特性の解析を行う予定でいる。各種細胞の細胞間相互作用の解析も行う予定でおり、内皮細胞のタイトジャンクション蛋白 (claudin-5, occluding, ZO-1など) の発現評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランポーター（GLUT1）アミノ酸トランスポーターなど）、P糖タンパクの発現を指標とした免疫染色法およびWestern blot 法により検証・評価を行う。ペリサイト由来の微小環境タンパク質と内皮細胞のインテグリン受容体を介したシグナルの解析も進める予定でいる。ひきつづき、共培養モデルにむけて各種分化細胞を用いてtrans-endothelial electrical resistance (TEER)測定によるバリア機能の評価およびSodium fluorescein (Na-F) による細胞透過性の評価、供給・排出輸送系トランスポーター（グルコーストランスポーター（GLUT1）など）、P糖タンパクの発現およびそれら輸送能の評価をする。
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