| 研究課題/領域番号 |
20K08101
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52040:放射線科学関連
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
小川 良平 富山大学, 学術研究部医学系, 准教授 (60334736)
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| 研究分担者 |
鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (30524243)
趙 慶利 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (90313593)
渡部 明彦 富山大学, 学術研究部医学系, 講師 (20377253)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2020年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | がん幹細胞 / 上皮間葉転換 / CRISPR-Cas9 / 遺伝子発現可視化 / 2A配列 / ゲノム編集 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
がん細胞での上皮間葉転換(EMT)はがん悪性化のプロセスであるが、がん治療の刺激でも誘導されうる。EMTは、治療抵抗性でがんの再発原因となりうるがん幹細胞(CSC)の形成に関与しているが、その形成メカニズムはよくわかっていない。がん細胞へのゲノム編集によりEMTやCSCの関連遺伝子の下流にそれぞれ異なる発現検出の容易なレポーター遺伝子を導入することで、EMT後にCSCになる細胞とならない細胞を分画することが可能となる。分画したそれぞれの細胞の遺伝子発現の比較などを基にCSC形成のメカニズムの解析を行い、それをもとに最終的にはCSC形成を抑制しながら実施する新たながん治療の可能性を探る。
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| 研究実績の概要 |
肝臓がん由来のHepG2細胞と前立腺がん由来のDU145細胞では、EMT後にCSCマーカー発現の増加を以前に確認している。そこで、それぞれのOct4遺伝子の下流にEGFP遺伝子をCRISPR-Cas9で導入して作成した細胞を、昨年度、前立腺がん由来のLNCaPをもとに作成したOct4遺伝子発現可視化細胞と同様に、EMT誘導剤を含む培地（EMT培地）および CSC-Sphere培地（CSC培地）での培養を行った。EMT培地での培養ではOct4下流に結合したEGFPの発現は顕著な増強は認められなかったが、CSC培地では細胞全体の蛍光として約２倍程度の発現増強を示すクロンを複数取得した。
Medical Science Digest誌（2022年48/12月号）に「放射線により誘発する腫瘍内細胞死の可視化」というタイトルで総説を発表した。本総説では、細胞内にインテインを利用したルシフェラーゼ活性のオン・オフスイッチを構築し、放射線によって引き起こされるアポトーシス及びネクローシスでこのスイッチを制御することでそれぞれの細胞死を可視化した。構築したこれらの細胞を利用して、放射線により引き起こされる細胞死の解析を行ったことについて報告した。また、日本放射線腫瘍学会第59回生物部会学術大会で、「高線量X線照射による腫瘍内アポトーシスの誘発メカニズム」というタイトルで発表をおこなった。本発表では、アポトーシスを可視化するために構築した細胞を利用して、高線量放射線により引き起こされるアポトーシスのメカニズムについて解析したことを報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
Oct4遺伝子の下流にCRISPR-Cas9でEGFP遺伝子を導入したOct4発現可視化細胞をHepG2細胞に加えDU145細胞でも構築した。これらを使用することで、EMT誘導などによる、CSCへの変化をEGFPの緑色蛍光で追跡できる可能性があると考えて構築し、現在解析中である。
EMTのスイッチ遺伝子としても知られているE-カドヘリンの下流にCRISPR-Cas9でDsRed遺伝子を導入するための組換え用プラスミドを構築した。これらを使用してLNCaP細胞で目的の組換え細胞の構築を試みたが、組換え体をこうてちくできなかった。CRISPR-Cas9による目的部位の切断は行われているようであるため、その後の相同組換え効率の問題ではないかと考えているが、原因は不明確のままである。以前、E-カドヘリンの下流に、DsRed遺伝子ではなく、同調発現するEGFP遺伝子を同じように導入した組換え細胞を構築したことがあり、DsRed遺伝子を導入できないことはないと思われる。現在、最初から少し異なる設計で構築を繰り返しており、できるだけ早く、新たにLNCaP細胞で組換え体を作成して、解析をおこなっていく予定である。HepG2細胞やDU145細胞でも可能であれば、組換え細胞を構築して解析したい。このために、一年間延期させていただいた。
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| 今後の研究の推進方策 |
DsRed遺伝子をE-カドヘリン下流に相同組換えにより導入するためのベクターは、異なる相同領域を利用した二種類のベクターをほぼ構築し直したので、今後はそれらの確認と、それらを使用して新たな可視化細胞を作成する予定。なんとか取得して、EMTの可視化、さらには、それを用いて、CSC形成の可視化が可能であることを示したい。LNCaP細胞で実施する予定であるが、うまくいけば他の細胞でも順次構築したい。
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