尿中スプライシング産物をバイオマーカーとした筋ジストロフィー治療評価系の検証

研究課題

研究課題/領域番号	20K08221
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
研究機関	兵庫医科大学
研究代表者	田中靖彦兵庫医科大学, 医学部, 非常勤講師 (20595045)
研究分担者	李知子兵庫医科大学, 医学部, 講師 (10596042) 下村英毅兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30441273) 竹島泰弘兵庫医科大学, 医学部, 教授 (40281141) 奥野美佐子兵庫医科大学, 医学部, 助教 (60646553)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2024-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円) 2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円) 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円) 2020年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
キーワード	Duchenne型筋ジストロフィー / エクソンスキッピング / extracellular RNA / アンチセンスオリゴヌクレオチド / 尿中exRNA
研究開始時の研究の概要	Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)に対し、エクソンスキッピングを誘導する治療法の臨床への応用が開始された。しかし、個々の症例における有効性を評価するバイオマーカーが無いことが治療を推進する上で妨げとなっている。申請者は尿中に排泄されるmRNAが筋組織におけるスプライシングを反映する可能性を着想した。そして、患者尿由来mRNAを解析することにより、個々の症例におけるエクソンスキッピング誘導治療の有効性を非侵襲的かつ簡便に評価するシステムを構築可能と考えた。本研究の成果により、臨床応用が開始されようとしているエクソンスキッピング誘導治療が大きく推進するものと期待される。
研究実績の概要	Duchenne型筋ジストロフィー(Duchenne Muscular Dystrophy：DMD)に対し、エクソンスキッピングを誘導する治療法の臨床への応用が開始された。「DMDに対するエクソンスキッピング誘導治療」は本邦でも迅速承認を受けており、現在最も実績と有効性のある根治療法といえる。しかし、細胞レベルにおいてアンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense Oligo Nucleotide: AS-Oligo）によるエクソンスキッピング効率には差があることが想定されており、個々の症例における有効性を評価するバイオマーカーが無いことが治療を推進する上で妨げとなっている。申請者は尿中に排泄されるmRNAが筋組織におけるスプライシングを反映する可能性を着想した。そして、患者尿由来mRNAを解析することにより、個々の症例におけるエクソンスキッピング誘導治療の有効性を非侵襲的かつ簡便に評価するシステムを構築可能と考えた。本研究の成果により、臨床応用が開始されようとしているエクソンスキッピング誘導治療が大きく推進するものと期待される。2022年度は、血中RNA（extracellular RNA: exRNA）におけるスプライシングパターンを解析するシステムの構築とともに、AS-oligo投与症例におけるジストロフィンRNAスプライシングパターンの解析を行った。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由理由筋細胞RNAおよびexRNAにおけるスプライシングパターンを解析するシステムの構築を行った。各症例ごとにReverse transcription (RT) -PCR法によって、ジストロフィンmRNAを増幅し、スプライシングを解析系を確立した。尿よりRNAを抽出するシステムの構築を進めているが、回収率が悪くシステムの構築が進んでおらず、血中RNAの解析を並行して進めているため。
今後の研究の推進方策	血中および尿中exRNA解析システムの構築を進めるとともに、筋細胞RNAおよび血中・尿中exRNAにおけるスプライシングパターンが関連していることの検証を行う。その上で、DMD患者に対しAS-oligoによるエクソンスキッピング誘導を行った際の、血中・尿中exRNAにおけるスプライシングの検討を行う。また、DMDモデルマウスであるmdxマウスに対しAS-oligoによるエクソンスキッピング誘導を行い、経時的に筋mRNAと血中・尿中exRNAの解析し、両者が相関することを検証する。

報告書

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