研究課題/領域番号 |
20K08290
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 基金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分53010:消化器内科学関連
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研究機関 | 福島県立医科大学 |
研究代表者 |
阿部 和道 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (30468128)
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研究分担者 |
高橋 敦史 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40404868)
林 学 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (80745787)
大平 弘正 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90274951)
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研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2020年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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キーワード | 自己免疫性肝炎 / 腸内細菌叢 / Veillonella dispar / Tfh細胞 / 口腔・腸内細菌叢 / 濾胞性ヘルパーT細胞 / Veillonella / 口腔・腸内細菌 |
研究開始時の研究の概要 |
腸内から検出される口腔細菌による全身疾患への影響に大きな注目が集まっています. また, 濾胞性ヘルパーT (Tfh)細胞の機能低下が腸内細菌叢の異常や免疫系の過剰な活性化を引き起こすことが明らかとなっています. 我々は, 自己免疫性肝炎(autoimmune hepatitis; AIH)患者に口腔細菌叢異常を認め, 腸内細菌叢と関連すること, AIHの病態にTfh細胞が関与することを報告しています. 口腔-腸管連関を介したAIH発症や肝炎悪化が想定されますが, 口腔細菌の直接的な影響は不明です. 本研究の目的は, AIH患者の唾液や口腔細菌がAIHの病態におよぼす影響を明らかにすることです.
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研究実績の概要 |
AIHマウスモデル作成:メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク(0.5-2mg/mLを0.5mL)とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬(ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW)を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。 AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料(Sweetener Sweet’n Low、サッカリン)60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl(Veillonella dispar:株式会社KACから購入)を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬(ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW)を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。 今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
AIHマウスモデルが予定する肝炎所見を呈していない。Veillonella disparの培養管理も検討する。
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今後の研究の推進方策 |
AIHマウスモデルがうまく作成できれば、Veillonella disparの培養管理し投与していく。うまく作成できない場合は、LPSの腹腔内投与を行い炎症が惹起された環境でAIHマウスモデルの肝炎変化を確認する。 さらに、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.
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