| 研究課題/領域番号 |
20K08760
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
武山 雅博 奈良県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (30572010)
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| 研究分担者 |
野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (50326328)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2020年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 第VIII因子 / 活性化プロテインC / 活性型プロテインC / プロテインS / 血友病 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
凝固第VIII因子（FVIII）は凝固反応において必須の因子であり、その欠乏により血友病Aを起こす。近年、半減期延長型製剤が広く使われようになってきたが、半減期延長効果は十分ではなく、新規FVIII製剤の開発が求められている。一方、FVIIIは活性型プロテインC (APC)及びプロテインS (PS) により不活化されるが、その不活化機序は完全には解明されていない。本研究ではFVIII上のAPC/PSの結合部位を同定し不活化機序の解明を行い、FVIII上のAPC/PS結合部位のアミノ酸を置換することで、APC/PSとの結合能が弱い変異FVIIIを作製し、新規製剤としての開発を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、FVIIIを中心とした凝固・抗凝固機能のさらなる解明と、抗凝固機能を受けにくい変異FVIIIを作成することにより、安定型・長時間作用型 FVIII製剤へ応用することである。我々が目指す新規FVIII製剤は、活性化プロテインC(APC)/プロテインS(PS)の結合部位を変異させた全く新たな機序による製剤 である。新規FVIII製剤はAPC/PSと の結合能が弱く、APC/PSにより不活化されにくいため、従来のFVIII製剤より安定性が高く、長時間作用すると考えられる。 これまでに、FVIII上のAPC結合部位 の詳細な同定を行い、APCがFVIII軽鎖(A3ドメイン)アミノ酸残基2007-2016に結合することを示した。これらの研究をもと に、FVIII重鎖(A2ドメイ ン)上の新規APC結合部位の同定について研究を行った。SPR-assayにより、DEGR-APCと400-429ペプチドが結合し、同領域がAPCの結合部 位であることが示唆された。FVIIIはAPCにより開裂を受け、不活化されるが、その不活化が420-429ペプ チドの存在により阻害されるかを検討した。420-429ペ プチド存在下ではFVIIIのAPCによる不活化は、420-429ペプチド非存在下と比べて低下しており、420-429ペプチドがAPCの 作用を阻害することを示した。さら に、APCと420-429ペプチドが、EDC クロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することが明らかになっ た。さらに、western blottingによ りAPCと420-429ペプチドをEDCクロスリンカーさせたbandを、アミノ酸シークエンスすることを試みたが、得られたバンドが 非常に薄く、アミノ酸シーケンスを断念した。現在、アミノ酸配列420-429中の塩基性アミノ酸であるR421, K422, K424, K425, R427をアラニンに変異させた変異FVIIIを作成中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
PCと420-429ペプチドが、EDCクロスリンカーにより結合するかをWestern blottingを用いて検討を行い、APCと420-429が直接結合することがわかったが、得られたwestern blottingのバンド濃度が薄く、アミ ノ酸シーケンスを行う事ができなかった。従って、FVIIIのアミノ酸残基420-429のどのアミノ酸がAPCと結合するのかを同定することができなかった。これまでのFVIIIとプロテインSとの結合部位の同定やFVIIIとFXとの結合部位の同定の研究結果から、FVIII と他の凝固因子・抗凝固因子はFVIII上の塩基性あるいは酸性アミノ酸と結合 することが多いとわかっている。現在、アミノ酸残基420-429のうち、塩基性アミノ酸であるR421, K422, K424, K425, R427をアラニンに変異させた変異FVIIIを ベビーハムスター腎臓細胞を用いて発現させ、蛋白の精製に成功したが、一部の変異FVIIIは回収量が非常に少なく精製に難渋している。引き続き、変異タンパク質の発現を試みている。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異FVIII(R421A, K422A, K424A, K425A, R427A)の発現、生成を行う。得られた変異FVIII蛋白を用いて以下の検討を予定している。
1)APCによる変異FVIIIの開裂をwestern blottingで検討する
2)変異FVIIIのAPCによる不活化をFXa生成試験で検討する
3変異FVIIIとAPCの結合能をSPR-based assayで検討する
これらの検討により、FVIIIのAPC結合部位を詳細に明らかにする予定である。
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