| 研究課題/領域番号 |
20K08867
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54040:代謝および内分泌学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
秦野 修 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (40164850)
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| 研究分担者 |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
竹森 洋 岐阜大学, 工学部, 教授 (90273672)
大西 健 茨城県立医療大学, 保健医療学部, 名誉教授 (50152195)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 塩誘導キナーゼ / 質量分析 / プロテオミクス / ステロイドホルモン / 近接依存性ビオチン化酵素 / BioID / AlphaScreen 法 / 標的プロテオミクス / ステロイドホルモン産生 / 質量分析法 / Salt-Inducible Kinases / コムギ胚芽無細胞タンパク質合成 / 卵巣 / 女性生殖機能 / ステロイドホルモン産生組織 / コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は副腎皮質のステロイド産生に影響を及ぼす因子として見出された塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3）の、ステロイド産生組織等における機能探索を目的とし、SIKsに強く結合するタンパク質のスクリーニングを行う。特に転写因子群、プロテインキナーゼ群に標的を絞り、これらのタンパク質群との結合アッセイを網羅的に行なう。又、SIKs欠損マウスの解析と共に、ステロイド産生能等における新たなSIKsの機能を推察する。
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| 研究実績の概要 |
塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3)はAMPKファミリーに属し、SIK1,2,3 の各欠損/変異マウスはステロイドホルモン産生酵素の発現異常、生殖異常、代謝異常、軟骨形成異常、睡眠異常、虚血性疾患などの多彩な異常を呈する。これら多様な表現型異常に関与する SIK1,2,3 の機能発現機構を明らかにする目的で、SIK1,2,3 に結合するタンパク質について、愛媛大学プロテオサイエンスセンターが構築した約8,300種のヒトタンパク質アレイ（DNA結合タンパク質群やプロテインキナーゼ群などを機能種別にほぼ網羅的に含む）から AlphaScreen 法を用いて、SIK1,2,3 各種の全長タンパク質との結合実験を行ない、SIK1,2,3 各種に強く結合するヒトタンパク質を、各々約20種同定した。これらの AlphaScreen 結合実験は、in vitro で合成されたタンパク質同士の結合スクリーニングであるが、今年度は、より生体（in vivo）に近い培養細胞中での SIK1の相互作用タンパク質を同定するために、最近、開発された近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を用いて、培養細胞内におけるSIK1の結合/相互作用タンパク質の同定（BioID法）を行っている。本研究では、SIK1-3のうち最初にステロイド産生に関与する分子として単離された SIK1 について、AirID との融合cDNA (AirID-SIK1と逆順のSIK1-AirID)を作成後、ヒトHEK293A細胞に導入し、近接位に存在してビオチン化されるタンパク質の網羅的同定をLC-MS/MS法で行なったところ、AirID 単独導入に比べて、AirID-SIK1 融合タンパク質導入時において強くビオチン化されるタンパク質として、AirID-SIK1/AirID のビオチン化量比が50以上のタンパク質が、17個同定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト塩誘導キナーゼ（SIKs)の全長タンパク質と、ヒトタンパク質（転写因子群やプロテインキナーゼ群等をほぼ網羅的に含む）との in vitro での結合スクリーニング実験を行い、又、生体（in vivo）により近い培養細胞条件下においてSIKsと相互作用するタンパク質を同定するために、ヒトSIK1の全長タンパク質に近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を連結した発現プラスミドを作成し、培養細胞中でのSIK1の近接位に存在するタンパク質（結合/相互作用タンパク質）の網羅的な同定を、LC-MS/MS法で行っているから。
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| 今後の研究の推進方策 |
塩誘導キナーゼ(SIKs)の機能発現機構を明らかにする目的で、生体（in vivo）により近い培養細胞内での、SIK1 の相互作用タンパク質を同定し、又、並行して行っている SIK2,3 結合タンパク質の解析との比較から、SIK1,2,3 全体で共通の、及び、SIK1,2,3 各々に固有の結合タンパク質を同定し、SIK1,2,3 タンパク質の個々の機能発現機構の相違などを明らかにしていきたい。又、同定されたタンパク質において、主にステロイドホルモン産生細胞/組織での発現/機能解析等を行っていきたい。
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