| 研究課題/領域番号 |
20K08867
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54040:代謝および内分泌学関連
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
秦野 修 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (40164850)
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| 研究分担者 |
竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
竹森 洋 岐阜大学, 工学部, 教授 (90273672)
大西 健 茨城県立医療大学, 保健医療学部, 名誉教授 (50152195)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 塩誘導キナーゼ / AlphaScreen 法 / 標的プロテオミクス / ステロイドホルモン産生 / 質量分析法 / Salt-Inducible Kinases / コムギ胚芽無細胞タンパク質合成 / 卵巣 / 女性生殖機能 / ステロイドホルモン産生組織 / コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系 / ステロイドホルモン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は副腎皮質のステロイド産生に影響を及ぼす因子として見出された塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3）の、ステロイド産生組織等における機能探索を目的とし、SIKsに強く結合するタンパク質のスクリーニングを行う。特に転写因子群、プロテインキナーゼ群に標的を絞り、これらのタンパク質群との結合アッセイを網羅的に行なう。又、SIKs欠損マウスの解析と共に、ステロイド産生能等における新たなSIKsの機能を推察する。
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| 研究実績の概要 |
塩誘導キナーゼ（Salt-Inducible Kinases: SIK1,2,3)はAMPKファミリーに属し、SIK1,2,3 の各欠損/変異マウスはステロイドホルモン産生酵素の発現異常、生殖異常、代謝異常、軟骨形成異常、睡眠異常、虚血性疾患などの多彩な異常を呈する。これら多様な表現型異常に関与する SIK1,2,3 の機能発現機構を明らかにする目的で、SIK1,2,3 に結合するタンパク質について、ヒト転写因子群、シグナル伝達関連分子群等から、in vitro での網羅的なスクリーニングを行った。ヒトSIK1,2,3 各種の全長タンパク質をコムギ胚芽無細胞系で合成し、ビオチン化を行った後、愛媛大学プロテオサイエンスセンターが構築した約8,300種のヒトタンパク質アレイ（転写因子等のDNA結合タンパク質:1,334種、プロテインキナーゼ群:483種、epigenetic 関連因子:861種などを機能種別にほぼ網羅的に含む）から AlphaScreen 法を用いて、SIK1,2,3 各種の全長タンパク質との結合実験を行ない、SIK1,2,3 各種に強く結合するヒトタンパク質を、各々約20種同定した。又、これらの Alphascreen 結合実験は、in vitro で合成されたタンパク質同士の結合スクリーニングであるが、より生体（in vivo）に近い培養細胞中での、SIK1,2,3 の相互作用タンパク質を同定するために、SIK1,2,3 の各全長タンパク質に、最近、開発された近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を連結した発現プラスミドを構築し、培養細胞条件下における塩誘導キナーゼの結合/相互作用タンパク質の同定の準備を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
塩誘導キナーゼ（SIK1,2,3)の各全長タンパク質と、ヒトタンパク質（転写因子群やプロテインキナーゼ群等をほぼ網羅的に含む）との in vitro での結合スクリーニング実験を行い、又、生体（in vivo）により近い培養細胞条件下において相互作用するタンパク質を同定するために、SIK1,2,3 の各全長タンパク質に近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を連結した発現プラスミドを作成すると共に、培養細胞中での塩誘導キナーゼの結合/相互作用タンパク質の同定の準備を進めているから。
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| 今後の研究の推進方策 |
塩誘導キナーゼの機能発現機構を明らかにするために、生体（in vivo）により近い培養細胞内での、SIK1,2,3 の相互作用タンパク質を同定するために、SIK1,2,3 の各全長タンパク質に近接依存性ビオチン化酵素(AirID)を連結した発現プラスミドを培養細胞に導入し、新たにビオチン化されるタンパク質を質量分析法を用いて網羅的に同定することにより、塩誘導キナーゼの結合/相互作用タンパク質を同定する。SIK1,2,3 各種に連結された近接依存性ビオチン化酵素は、培養細胞内で SIKs-AirID と近接位（10 nm 以下）に存在するタンパク質をビオチン化する。ビオチン化されたタンパク質は、質量分析（LC-MS/MS）法により同定可能であり、SIK1,2,3 の結合/相互作用タンパク質を網羅的に同定できる。又、同定されたタンパク質において、主にステロイドホルモン産生細胞/組織での発現/機能解析等を行っていきたい。
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