| 研究課題/領域番号 |
20K09914
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57020:病態系口腔科学関連
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
中島 和久 鶴見大学, 歯学部, 准教授 (90252692)
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| 研究分担者 |
二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 助教 (40435699)
小松 浩一郎 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (60153665)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 細胞分化 / 破骨細胞 / ウイルス感染 / 転写 / 翻訳 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
骨格の恒常性は遺伝子変異、内分泌系の変動、炎症並びにウイルス感染により破綻して骨 量が増減する。申請者は、アデノウイルスによるcDNA過剰発現が破骨細胞への分化を抑制 することを見出した。骨疾患発症に潜む未知のメカニズムを解明するために、DNAウイル ス感染により、
1, DNA/RNAセンサーがウイルスゲノムからの転写産物を認識して破骨細胞分化を抑制する。
2, 外来遺伝子の翻訳の増加が破骨細胞分化を抑制する。
という2つの可能性を 検証する。骨格の恒常性維持機構の新機軸を切り拓くとともに、その研究結果に基づいて組 織の破壊を抑止する新規薬物の開発基盤の構築を目指す。
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| 研究実績の概要 |
破骨細胞は単球・マクロファージ系の細胞に由来する多核細胞である。この細胞は単核前駆細胞から多段階の過程をへて特徴的な形態と機能を獲得する。この細胞の機能解析には各種ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が用いられてきたが、細胞の機能へのウイルスベクター感染、並びに発現カセットからのcDNA発現量の増加の影響は定かではない。
我々は、培養マウス破骨細胞分化の過程で、アデノウイルスベクターによりcDNAを発現するとTRAP陽性細胞の出現は認められるものの融合が極めて抑制されて、多核破骨細胞の形成が低下することを見出した。この抑制はcDNAを含まないベクターでは認められないが、発現カセットに導入されたcDNA配列には非依存的であり、GFP、beta-galactosidase、CreリコンビナーゼのいずれのcDNAも抑制した。従って、この抑制作用は転写と翻訳に依存すると予想できる。興味深いことに、この抑制作用は破骨細胞分化誘導後には消失した。
アデノウイルスベクター感染による破骨細胞形成抑制が内在性サイトカイン合成を経由するのか、感染細胞内での転写と翻訳に依存するのかを区別するために、シグナル強度の高いGFPを感染させた。するとGFP陽性細胞のみ破骨細胞形成抑制が現れた。従って、ウイルスベクター感染による破骨細胞形成抑制は感染細胞内での転写と翻訳に依存すると考えられる。
Cell-autonomousな破骨細胞分化抑制とその抑制解除のメカニズムを追求するために、破骨細胞分化に伴う発現量の変化を検討したところ、RANKL刺激で細胞内RNAセンサー分子発現量変動は認められなかったがウイルス感染で亢進した。一方、RANKL刺激後のウイルス感染により細胞内RNAセンサー分子発現量が変動した。これに伴い、破骨細胞形成を制御するサイトカインの発現は変化したが、破骨細胞形成抑制は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1）ウイルス感染による抑制性サイトカイン産生の亢進を介してcell non-autonomousに細胞分化を抑制する可能性がある。破骨細胞分化抑制作用を示すサイトカインの作用と、感染細胞内での転写と翻訳に依存するのかを区別するために、シグナル強度の高いCOP-GFPを感染させた。するとGFP陽性細胞にのみ破骨細胞形成の抑制が現れた。この抑制は破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化の進行に依存しており、RANKL刺激24時間後では、COP-GFP陽性細胞も破骨細胞を形成した。従って、アデノウイルスベクター感染による破骨細胞形成の抑制は感染細胞内での転写と翻訳に依存するcell autonomousな現象と考えられる。
2）破骨細胞分化における細胞内RNAセンサー分子群の役割を追求した。破骨細胞分化に伴う細胞内RNAセンサー分子の発現量の変化を検討したところ、RANKL刺激でMDA5の発現量変動は認められなかったが、ウイルス感染により発現量が増加した。この発現量の変化はRANKL刺激後24時間のCOP-GFP感染では認められなかった。最近のsingle cell解析では、破骨細胞分化は多くの分子種の発現変動を伴う多段階な過程であることが判明している。公共データベースのRNA-seq解析、並びに初代培養細胞の発現遺伝子解析を行い、RANKL刺激、並びにウイルス感染による細胞内DNA/RNAセンサー分子群と破骨細胞分化制御性サイトカイン類の網羅的発現解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
アデノウイルスベクター感染後はTRAP陽性細胞の出現は認められるものの、その融合が極めて抑制されて、多核破骨細胞の分化が低下することを見出した。ウイルス感染では、ウイルスゲノムあるいはウイルス構成タンパク質がパターン認識受容体の標的となる。アデノウイルスベクターの感染ではエンドソーム内でDNAセンサーToll-like receptor 9がウイルスゲノムを認識して下流の炎症性サイトカイン発現が促進する。しかし、cDNAを含まないアデノウイルスベクターは破骨細胞分化の抑制を示さないことから、TLR9に加えて他のRNA/DNAセンサーが破骨細胞分化制御に関与すると考えられる。実際、細胞質にはウイルスRNAのキャップ構造に特異性を示すRIG-Iや特異性の低いMDA5などのRNAセンサーが存在する。
一方、最近の遺伝子発現解析手法の進歩により、破骨細胞分化はマクロファージの細胞形質の抑制とともに破骨細胞特異的遺伝子の発現が進行する多段階の反応であることが判明している。そこで、破骨細胞分化におけるパターン認識受容体、RIG-I と MDA5を含む細胞内DNA/RNAセンサー分子群、並びに破骨細胞形成を制御するサイトカイン類の発現を網羅的に解析して、アデノウイルス感染によるCell-autonomousな破骨細胞分化抑制と、RANKL刺激によるその抑制解除のメカニズムに関わる分子を探索している。
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