| 研究課題/領域番号 |
20K10093
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
岸本 晃治 岡山大学, 歯学部, 客員研究員 (40243480)
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| 研究分担者 |
奥井 達雄 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (40610928)
伊原木 聰一郎 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (80549866)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | angiogenin / plexin-B2 / 口腔癌 / A375細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
Angiogenin（ANG）は、リボヌクレアーゼ活性を有する唯一の血管新生蛋白で、内皮細胞のみならず癌細胞や神経細胞で細胞増殖、生存、再生能力等の様々な生物活性を有する。2017年にANGレセプターがplexin-B2（PLXNB2）であることが報告されて以来、PLXNB2を介したANGの生物活性機序の解明が課題である。ANGは特に口腔癌組織の低酸素環境下で強発現するため、口腔癌治療の分子標的として有望と考えられる。本研究では、口腔癌におけるPLXNB2の発現とANGをリガンドとするPLXNB2の機能解析を行うことにより、ANG-PLXNB2経路を標的とした新規口腔癌治療の可能性を探求する。
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| 研究実績の概要 |
(目的)Angiogenin(ANG)は、リボヌクレアーゼ活性を有する唯一の血管新生蛋白として発見されたが、内皮細胞のみならず癌細胞や神経細胞で細胞増殖、生存、再生能力などの様々な生物活性を有する。2017年に、ANGレセプターがplexin-B2(PLXNB2)であることが報告されて以来、癌や神経変性疾患におけるPLXNB2を介したANGの生物活性機序が注目されている。本研究では、口腔癌におけるPLXNB2の発現とANGをリガンドとするPLXNB2の機能解析を行うことにより、ANG-PLXNB2経路を標的とした新規口腔癌治療の可能性を明らかにする。
(実施計画)1. これまでPLXNB2の発現が強い培養口腔癌細胞HSC-3を使用していたが、計画通りPLXNB2のノックダウンを行うことができなかった。このため、ANGが細胞増殖に深く関与していると考えられるヒト悪性黒色腫A375培養細胞に変更して、さらに以下の実験を行った。2. PLXNB2 shRNAプラスミドDNA(Sigma社)を使用し、LipofectamineTM 3000 Transfection Reagentを用いて遺伝子導入した。PLXN:SIGMA MISSION shRNA Plasmid DNA。Control:SIGMA MISSION pLKO.1-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA。3. Puromycinでセレクション後、A375細胞のstable shRNA transfectantを作製した。
(成果) HSC-3細胞からヒト悪性黒色腫A375細胞に変更して、PLXNB2 shRNA プラスミド DNAを遺伝子導入した。そして、stable shRNA transfectantを作製した。細胞を回収後、ウエスタンブロット法でPLXNB2の発現を調べたが、有意と言える低下は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
HSC-3細胞に加えて、A375細胞についても、PLXNB2 shRNAプラスミド DNAを遺伝子導入し、PLXNB2のノックダウンを試みた。Puromycinでセレクションはできているものの、タンパクレベルでのPLXNB2の有意な発現低下が確認できず、その後の実験に進めなかったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
ANGが細胞増殖に深く関与している培養細胞において、PLXNB2 stable shRNA transfectantの細胞を作製することが、本研究を遂行する上で必要である。Puromycinでのセレクションはできているため、遺伝子導入試薬を変更し、導入効率を上げる。
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