| 研究課題/領域番号 |
20K10206
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57070:成長および発育系歯学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
寺尾 文恵 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10510018)
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| 研究分担者 |
高橋 一郎 九州大学, 歯学研究院, 教授 (70241643)
春山 直人 九州大学, 歯学研究院, 准教授 (70359529)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2020年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | 歯学 / 発生・分化 / ヒストンアセチル化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
胎生期ラットおよびマウスの第一鰓弓の下顎隆起、第二鰓弓を用いて、器官培養法、高密度培養法、単層培養法においてHAT阻害剤を添加した培地を用いて、細胞増殖と軟骨分化への影響を検討する。続いて、HATのsiRNAを用いて局所的にノックダウンを行い、HATが下顎隆起や第二鰓弓の形態形成に及ぼす影響を組織学的に検討する。さらに、下顎の形態形成を時間的・空間的に制御する、各種サイトカインや転写因子の遺伝子発現の変化を検討し、ChIP解析を用いた転写制御機構解析を行う。
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| 研究実績の概要 |
われわれは、これまで、胎生期における顎顔面のパターン形成制御機構の解明を試みてきた。顎顔面領域の発生におけるエピジェネティック制御機構に着目し、ヒストン脱アセチル化酵素(Histone deacetylase, HDAC)の阻害は、下顎隆起細胞の増殖、下顎隆起のパターン形成を乱すことを示した。
本研究では、HDACとは逆の働きを有するヒストンアセチル化酵素(Histone acetyltransferase, HAT)による顎顔面形態形成の制御機構を解明することにより、HAT/HDACによるアセチル化バランス制御を介した、顎顔面領域の形態制御メカニズムの解明を目指すこととした。
初年度は、マウス胎生期下顎隆起由来細胞の単層培養において、C646の添加により、下顎隆起由来細胞の細胞増殖の低下を確認し、昨年度は、単層培養ではなく、高密度培養にC646を添加し、軟骨ノジュールの形成の抑制を確認した。
今年度は、マウス胎生期下顎隆起の器官培養を行い、パターン形成におけるHATの役割の解明を目指した。マウス下顎隆起の器官培養において、培地にC646を添加することによりHAT阻害を行ったところ、下顎隆起の発育およびメッケル軟骨の形成が抑制されることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
通常、器官培養に使用している培地を初年度より注文していたが、国内・国外在庫がなく、原材料不足により納期が遅延し、器官培養を行えなかったため。2022年10月にようやく納品され、実験を再開している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度行う予定であった下記の実験を行う
１）下顎隆起の器官培養におけるHAT阻害 - 改良型 Trowell 法により摘出した下顎隆起および第二鰓弓の器官培養を行う。C646添加後、経時的にタンパクを
抽出し、HAT阻害剤によるヒストンH3のアセチル化の減少を確認する。また、C646の各濃度において、培養器官を固定、パラフィン包埋後、連続切片を作製し、組織学的変化を検討する。
２）局所的HATノックダウン実験 - 摘出した下顎隆起および第二鰓弓にHAT siRNAをエレクトロポレーション法により導入し、器官培養を7日間継続する。
siRNAをインジェクションする部位は、下顎隆起中央部、側方部の二領域に分ける。ホールマウントアルシアンブルー染色を行い、実体顕微鏡下で軟骨形成の状態を観察する。さらに、in situ hybridization 法を用いて、顎顔面の形態形成を時間的・空間的に制御していると考えられている遺伝子発現パターンの変化を経時的に検討する。
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