| 研究課題/領域番号 |
20K10456
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
平田 幸代 日本医科大学, 医学部, 助教 (40322515)
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| 研究分担者 |
川田 智之 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00224791)
稲垣 弘文 日本医科大学, 医学部, 講師 (50213111)
李 英姫 日本医科大学, 医学部, 准教授 (60350039)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2020年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | コリンエステラーゼ / Sandwich ELISA / オレイン酸 / ホモ比活性 / DELFIA / 脂肪肝 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
①血清ChEのSandwich ELISAの再現性、安定性、感度を向上させるために、新たにモノクローナル抗体を作製する。
②In vitroの脂肪肝モデルを用い脂肪蓄積量とChEとの関連性について、OAの濃度変化、添加後の経時変化におけるChEおよび肝で産生される蛋白の変化を遺伝子レベルおよび蛋白レベルで測定、解析を行う。
③ヒトの肝における脂肪沈着量と血清ChEとの関連性については、バイオバンクより得られた検体のChEを測定し、脂肪沈着量や血液検査等の患者情報と合わせ解析を行う。
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| 研究実績の概要 |
①オレイン酸(OA)の経時変化によるChE及びアルブミン発現への影響の検討：HuH-7細胞にOAを最終濃度0.6mMで添加して培養し、添加後0, 6, 12, 24hr後及び0, 1, 2, 3日後に培養上清とtotal RNAを採取した。遺伝子解析のためにRT-PCRを行い、G3PDHをコントロールとして、ChE及びアルブミンのmRNAの変化を解析した。その結果、ChEの発現はOA添加後1日が最も高く、３日目にはほぼ添加前までと同レベルまで戻った。一方、アルブミンの発現はOA添加後の時間による変化は認められなかった。
②ヒト血清中のChE抗原量測定、活性測定およびホモ比活性の解析：先ず少人数を対象として各測定を行った。非アルコール性脂肪肝炎(NASH)患者および健常者の血漿は、バックグラウンドをなるべく統一するため、人種は白人、性別は男性とし、それぞれの個人サンプル１０名ずつを購入した。血漿中のChE抗原量はSandwich ELISAで測定し、ChE活性は臨床検査機関へ外注した。ChEについては、活性値を抗原量で除したホモ比活性を算出した。ChE抗原量と活性値の間には正の相関が認められ、健常者およびNASH患者ともにほぼ同一の回帰直線が示された。NAＳＨ患者のChE抗原量、活性値は、健常者よりも低値を示した。ChEホモ比活性は、健常者ではほぼ一定となったが、一名外れ値を示した。NASH患者のホモ比活性は健常者に比べてバラつきが大きいものの、やや高値を示した。
③人間ドックのデータを用いた脂肪肝とChEとの関連性の解析：人間ドック１年間分のデータを取得済みであり、脂肪肝やメタボリックシンドロームとChEとの関連性について、解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
試薬製造の停止や新型コロナ感染症による配送の遅延により、試薬の調達が遅れ、実験の実施が遅延したためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
①オレイン酸(OA)の経時変化によるChE抗原量への影響の検討：昨年度において遺伝子発現の影響を検討した際に回収した培養上清サンプルを用い、ChEの抗原量の測定を行う。同じサンプルを用いて、アルブミンの抗原量も測定し、比較する。
②ChE活性の測定方法の検討および選定：ChE活性測定方法として、基質の種類や発色方法などを調べ、HuH-7細胞の培養上清中の活性を測定できる方法を検索する。また、活性測定ができるような培養条件等の変更が必要であれば実施する。
③ヒト血漿中の肝酵素レベルとChEホモ比活性の関連性の検討：購入したＮＡＳＨ患者および健常者の血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を測定し、ChEホモ比活性との関連性について解析する。
④人間ドックのデータによるChEと脂肪肝、メタボリックシンドロームとの関連性の解析：取得した人間ドックデータを解析し、ChEと脂肪肝、メタボリックシンドロームとの関連性について統計解析を行う。
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