| 研究課題/領域番号 |
20K15313
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分34020:分析化学関連
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| 研究機関 | 東京都立大学 |
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研究代表者 |
八巻 優佳 東京都立大学, 理学研究科, 客員研究員 (80781525)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2021-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2020年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2021年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
2020年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | 質量分析 / プロテオミックマッピング / RNA / 転写後修飾 / LC-MS |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、RNAとタンパク質の相互作用を、質量分析計およびデータベースサーチを用いて網羅的にマッピングする方法を開発する。そのために、まずはヒト培養細胞を用いて標的RNAと相互作用するタンパク質の精製システムを構築する。次に、精製されたタンパク質を質量分析計で検出し、標的RNAに結合するタンパク質を同定する。本研究で開発する方法は、標的RNA近傍のタンパク質をアスコルビン酸ペルオキシダーゼ変異体により触媒する近接依存性標識法を用いるものであり、短時間のビオチンラベリングのため、乖離が早いとされるRNA-タンパク質間相互作用をも明らかにする利点を有する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ノンコーディングRNA（ncRNA）とタンパク質の相互作用を、質量分析計およびデータベースサーチを用いて網羅的にマッピングする方法を開発する。そのために、まずはヒト培養細胞を用いて標的ncRNAと相互作用するタンパク質の発現・精製システムの構築を目指した。
当初の計画では、標的ncRNA近傍のタンパク質をビオチン・リガーゼ変異体であるTurboIDにより触媒する近接依存性標識法を用いる方法を立案した。特徴として、細胞に対する毒性がなく、短時間のビオチンラベリングのため、乖離が早いとされるRNA-タンパク質間相互作用をも明らかにする利点を有する。しかし、これはタンパク質の表面に位置するリジン残基が限定的にビオチン化されるため、ビオチン化がタンパク質のアミノ酸組成により影響を受ける懸念が生じた。そこで本研究では、リジン残基に限らずビオチン化するアスコルビン酸ペルオキシダーゼAPEX2を用いることにした。
細胞に導入するncRNAには、バクテリオファージMS2由来の特異配列（タグ）を付加した。一方、APEX2発現ベクターには、同時にMS2 タグを認識し結合するMS2 コートタンパク質（MS2 coat protein, MCP）配列を組み込んだ。これら2つのベクターとビオチンを同時に細胞に導入すると、MS2タグにMCPが結合し、ncRNA近傍のタンパク質がAPEX2によりビオチン化される。これまでに、ヒト胚性腎臓細胞由来HEK293T細胞にベクターを導入し、ウエスタンブロッティングにてAPEX2が発現されることを確認した。また、細胞内のncRNAベクターの転写状況は、定量PCRにより検証した。ベクターを導入した細胞より抽出したRNAを逆転写し、得られたcDNAを鋳型とした定量PCRにより、導入したncRNAが細胞内で転写されることが明らかになった。
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