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卵巣予備能が牛における原始卵胞の活性化と初期卵胞発育に及ぼす影響

研究課題

研究課題/領域番号 20K15672
研究種目

若手研究

配分区分基金
審査区分 小区分42020:獣医学関連
研究機関岐阜大学 (2023)
北海道大学 (2020)

研究代表者

坂口 謙一郎  岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (40867545)

研究期間 (年度) 2022-12-19 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
キーワード卵巣予備能 / 原始卵胞活性化 / 二次卵胞 / 体外発育培養 / 牛 / In vitro growth (IVG) / 卵胞
研究開始時の研究の概要

卵巣内に存在する原始卵胞数は、卵子の受精能や性ステロイドホルモン分泌に関わる卵巣の潜在的能力 (卵巣予備能) と相関し、ヒトや牛の繁殖能力の指標となることが知られている。しかし、卵巣予備能が原始卵胞の卵胞発育への動員 (原始卵胞活性化) や、卵胞腔形成前の初期卵胞の発育にどのような影響を及ぼすかは不明である。本研究は、牛卵胞の体外発育培養 (IVG) 技術を用いて、卵巣予備能が原始卵胞活性化と初期卵胞の発育や、ホルモンおよび成長因子の分泌、卵胞の分化に重要な転写因子の発現に及ぼす影響を明らかにすると共に、得られた結果を元に、発生能の高い卵子を生産可能なIVG系を開発する。

研究実績の概要

卵巣内の原始卵胞数は、卵子の受精能や性ステロイドホルモン分泌に関わる卵巣の潜在的能力 (卵巣予備能) と相関し、ヒトや牛の繁殖能力の指標となる。しかし、卵巣予備能が原始卵胞の卵胞発育への動員 (原始卵胞活性化) や、卵胞腔形成前の初期卵胞の発育に及ぼす影響は不明である。本研究は、牛卵胞の体外発育培養 (IVG) 技術を用いて、卵巣予備能が原始卵胞活性化と初期卵胞の発育に及ぼす影響を明らかにし、得られた結果を元に、発生能の高い卵子を生産可能なIVG系を開発することを目的として以下の検討を行った。
1)卵巣組織中の原始卵胞数を卵巣予備能の指標として群分けを行い、体外発育培養および組織学的な評価により原始卵胞の活性化を比較したところ、卵巣予備能が低い場合の方が、体外での原始卵胞活性化が高率に起こることが明らかとなった。このことは、原始卵胞自身に由来する因子が原始卵胞の活性化を抑制しており、卵巣予備能が低い場合、原始卵胞の枯渇が早まることを示唆している。その機構の詳細を明らかにするため、使用済み培養液を用いて、卵胞発育に関連する各種内分泌因子の酵素免疫学的測定の条件検討を実施した。
2)安定して実験を遂行するための課題であった二次卵胞の回収個数について、機械的単離法を改善することで、一回の採材で40個程度をコンスタントに回収できるようになった。一方、既報に基づく培養法では、原始卵胞数の活性化および二次卵胞の発育のベースが低かったため、基礎培地および添加剤についての詳細な検討による培養系の見直しを行った。その結果、双方の培養系に最適な基礎培地を見出すと共に、3種の添加剤により、二次卵胞の発育能を促進できることが明らかになった。改善した培養系により体外で発育させた二次卵胞を体外成熟培養に供し、免疫蛍光染色による評価を行ったところ、減数分裂の再開および第一減数分裂前期への到達を確認した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初、実施予定であった卵胞発育に関連する各種内分泌因子の酵素免疫法による濃度測定および卵巣組織の免疫染色はまだ完了していない。一方、卵巣予備能の異なる卵巣に由来する卵巣組織の固定包埋済みのサンプルおよび免疫染色に必要な抗体類の準備は終了しており、酵素免疫測定法に用いる使用済み培地の回収および条件検討も終了している。今後、これらを用いた組織学的解析を最優先で実施する。一方、初年度の課題であった二次卵胞の回収個数については、基礎的な検討を行うことで改善がみられた。さらに、原始卵胞の活性化能および二次卵胞の発育能のベースを高めるために計画年度3年目に実施予定であった培養系の改善を前倒しで実施したことにより、原始卵胞・二次卵胞双方の培養系の最適化に近づく条件を見出すと共に、牛の体外発育二次卵胞由来卵子の体外成熟培養による第一減数分裂前期への到達という一定の成果を得られた。加えて、体外発育後の二次卵胞から採取した卵子を供する計画にある初期胞状卵胞由来卵子の体外発育培養系において、培養系の温度に着目した検討を進め、これまで (4-39%) で最も高い胚盤胞率 (60%) を達成した。これらの研究を多角的に進めることで、体外で発育した二次卵胞期以前の卵胞由来の子牛生産という目的の達成に向けた進展がみられることから、上記の評価とした。

今後の研究の推進方策

これまでに得られた卵巣予備能が異なる卵巣に由来するサンプルを用いた免疫染色による卵胞発育関連因子の発現および局在を評価すると共に、各種内分泌因子の酵素免疫法による評価による濃度測定を行い、卵巣予備能が高い場合および低い場合の原始卵胞活性化の特徴づけを行う。さらに、これまでに最適化を実施してきた体外発育培養系を用いて、卵巣予備能は二次卵胞の発育にも影響を与えるかを評価する。これらの検討を経て得られた情報をもとに、高い原始卵胞活性化能および二次卵胞発育能が期待できる体外発育培養系を考案し、体外発育由来卵子の体外での成熟・受精・発生能を評価する。

報告書

(2件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2020 実績報告書
  • 研究成果

    (18件)

すべて 2024 2023 2021 2020 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (14件) (うち国際学会 7件、 招待講演 3件)

  • [国際共同研究] エジンバラ大学/リーズ大学(英国)

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [雑誌論文] Relationship between Amino Acid Metabolism and Bovine In Vitro Follicle Activation and Growth2023

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi Kenichiro、Kawano Kohei、Otani Yuki、Yanagawa Yojiro、Katagiri Seiji、Telfer Evelyn E.
    • 雑誌名

      Animals

      巻: 13 号: 7 ページ: 1141-1141

    • DOI

      10.3390/ani13071141

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Effect of increased oxygen availability and astaxanthin supplementation on the growth, maturation and developmental competence of bovine oocytes derived from early antral follicles2020

    • 著者名/発表者名
      Chelenga Madalitso、Sakaguchi Kenichiro、Abdel-Ghani Mohammed A.、Yanagawa Yojiro、Katagiri Seiji、Nagano Masashi
    • 雑誌名

      Theriogenology

      巻: 157 ページ: 341-349

    • DOI

      10.1016/j.theriogenology.2020.07.023

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Follicle priming by FSH and pre-maturation culture to improve oocyte quality in vivo and in vitro2020

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi Kenichiro、Nagano Masashi
    • 雑誌名

      Theriogenology

      巻: 印刷中 ページ: 122-129

    • DOI

      10.1016/j.theriogenology.2020.01.023

    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Hypoxanthine improves oocyte growth and energy metabolism during in vitro growth of bovine secondary follicles2024

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi K, Ball L, Srsen V, Grosbois J, Picton HM, Telfer EE
    • 学会等名
      Fertility 2024
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Optimising media to support In vitro activation/IVA and In vitro growth/IVG of bovine primordial/preantral follicles2023

    • 著者名/発表者名
      Kenichiro Sakaguchi, Evelyn E Telfer
    • 学会等名
      Kenichiro Sakaguchi, Evelyn E Telfer
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Effects of high temperature within physiological range on the amino acid metabolism of in vitro growing oocyte-granulosa cell complexes derived from bovine early antral follicles2023

    • 著者名/発表者名
      Kawano K, Sakaguchi K, Ninpetch N, Yanagawa Y, Katagiri S
    • 学会等名
      The 49th Annual Conference of the International Embryo Technology Society
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 卵巣予備能って何? -生殖医療と獣医療の観点から-2023

    • 著者名/発表者名
      坂口謙一郎
    • 学会等名
      持続可能な発展のための国際基礎科学年 SRD一般公開シンポジウム「卵巣と精巣のかたち・はたらきと未来像」
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] OPUっていつやればいいの?-FSHを投与する時・しない時-2023

    • 著者名/発表者名
      坂口謙一郎
    • 学会等名
      北海道牛受精卵移植研究会第40回研究発表会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 牛の体内における卵巣内温度に基づいた培養温度が初期胞状卵胞に由来する卵子の体外発育および 発生能に及ぼす影響2023

    • 著者名/発表者名
      河野光平, 坂口謙一郎, 栁川洋二郎, 片桐成二
    • 学会等名
      第166回日本獣医学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] The base media used for the in vitro activation and growth of bovine immature follicles impacts on follicle energy metabolism2023

    • 著者名/発表者名
      Kenichiro SAKAGUCHI, Laura BALL, Vlastimil SRSEN, Johanne GROSBOIS, Helen M PICTON, Evelyn E TELFER
    • 学会等名
      第116回 日本繁殖生物学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] In vitro embryo production in ruminants2023

    • 著者名/発表者名
      Kenichiro Sakaguchi
    • 学会等名
      7th International Livestock Biotechnology Symposium, 60th the Philippine Society of Animal Science Scientific Meeting
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Effects of culture condition based on in vivo ovarian tissue temperature on the in vitro growth and developmental competence of oocytes derived from bovine early antral follicles2023

    • 著者名/発表者名
      Kawano K, Sakaguchi K, Yanagawa Y, Katagiri S
    • 学会等名
      International Symposium on Animal Bioscience 2023
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Plasma sex steroid hormone profiles after a single dose of epidural administration of follicle-stimulating hormone via caudal vertebrae in cattle2021

    • 著者名/発表者名
      1)Sakaguchi K, Yanagawa Y, Ninpetch N, Kawano K, Suda T, Yoshioka K, Katagiri S, Nagano M
    • 学会等名
      Fertility 2021
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] The effects of heat exposure on the growth and developmental competence of oocytes derived from early antral follicles in dairy cows2021

    • 著者名/発表者名
      Kawano K, Sakaguchi K, Furukawa E, Chelenga M, Yanagawa Y, Katagiri S
    • 学会等名
      The 47th Annual Conference of the International Embryo Technology Society
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 牛卵巣内の主席卵胞と黄体の存在が初期胞状卵胞由来卵子の核成熟能と顆粒層細胞の性ステロイドホルモン産生能に及ぼす影響2020

    • 著者名/発表者名
      坂口 謙一郎, 河野 光平, 栁川 洋二郎, 片桐 成二, 永野 昌志
    • 学会等名
      第163回日本獣医学会学術集会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] 暑熱が乳牛の初期胞状卵胞に由来する卵子の発育, 成熟および顆粒層細胞の性ステロイドホルモン産生能に及ぼす影響2020

    • 著者名/発表者名
      河野 光平, 坂口 謙一郎, 古川 瑛理, Madalitso Chelenga, 栁川 洋二郎, 片桐 成二
    • 学会等名
      第163回日本獣医学会学術集会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書
  • [学会発表] Astaxanthin supplementation during 8-days of IVG culture under different oxygen tensions promotes developmental competence of bovine oocytes derived from early antral follicles2020

    • 著者名/発表者名
      Madalitso Chelenga, 坂口 謙一郎, 古川 瑛理, 栁川 洋二郎, 片桐 成二, 永野 昌志
    • 学会等名
      第163回日本獣医学会学術集会
    • 関連する報告書
      2020 実績報告書

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公開日: 2020-04-28   更新日: 2024-12-25  

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