| 研究課題/領域番号 |
20K16557
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分52010:内科学一般関連
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
相羽 由詞 自治医科大学, 医学部, 助教 (60783694)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2021年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2020年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 簡易検査法 / 薬剤耐性菌 / CRISPR-Cas13a / バクテリオファージ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本申請では、CRISPR-Cas13a搭載キメラファージの塩基配列特異性を利用した細菌遺伝子変異の簡易検出法を確立する。CRISPR-Cas13aは標的遺伝子の塩基配列に対して極めて完璧な配列相同性を要求するため、１塩基の相違（SNP）を識別できると考え、本研究を計画した。既に、予備試験でCRISPR-Cas13aの設計を工夫することで検出遺伝子の1塩基の相違を感度良く鑑別することに成功した。この成果を生かして、核酸増幅や塩基配列の決定を行わずに、細菌の増殖の有無を目視観察するだけで鑑別できる、細菌遺伝子の簡易検出法を構築する。
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| 研究成果の概要 |
核酸の増幅を必要としない細菌遺伝子変異の簡易検査法の確立を目指した。モデル遺伝子にカルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌が持つIMP-1とIMP-6の1塩基相違を用いた。合計56種類のガイドRNAを合成し、CRISPR-Cas13aの配列特異的な認識による殺菌効果を評価した。最も感度が高いガイドRNA配列は10の-6乗以上の増殖を有意に抑制した。しかし、抑制効果がない配列も存在した。そのため、ガイドRNAを慎重に設計することで、僅か１塩基の相違を認識できることを見出した。本研究は、臨床現場で鑑別が困難な耐性遺伝子の検出のみならず、毒素遺伝子検出や感染症対策の分子疫学ツールとして応用が期待される。
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| 研究成果の学術的意義や社会的意義 |
本研究の成果は、核酸の増幅を必要としない細菌遺伝子変異の簡易検出法の確立である。本研究を通じて、CRISPR―Cas13aの設計を工夫することで、標的遺伝子が持つ１塩基の相違を感度良く鑑別できることを明らかにした。しかし、設計したCRISPR―Cas13aをファージに搭載技術には、回収量を向上させるためのさらなる検討が必要である。本課題の技術は、検体細菌と構築した殺菌キメラファージを共培養後に細菌の生死を目視確認のみで鑑別ができる。薬剤耐性菌の克服に向けて、細菌感染症の治療に資する薬剤耐性菌の早期検出や感染制御対策の日常的な環境調査に実装することができる簡易検査法になると期待される
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