| 研究課題/領域番号 |
20K16901
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
宮内 彰彦 自治医科大学, 医学部, 講師 (50570397)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2020年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 遺伝子治療 / Rett症候群 / MECP2重複症候群 / micro RNA / アデノ随伴ウイルスベクター / MECP2 / 低発現プロモーター / ヒトiPS細胞 / Mecp2欠損マウス / dCAS / AAVベクター |
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| 研究開始時の研究の概要 |
Rett症候群は女児に発症し、MECP2の変異により生じるが、MECP2の重複男児でも重度知的障害、難治性てんかんを発症する。よってRett症候群の遺伝子導入治療では、MECP2の発現が過剰であっても機能異常を来すため、導入する遺伝子の発現量を調節する方法、あるいは別の方法の開発が不可欠である。本研究では、遺伝子導入治療の方法として、AAVベクターにMECP2を導入し、低発現のプロモーターや内因性プロモーターを作成し過剰発現の調節を検討する。また、CRISPR-dCas9システムと遺伝子転写促進分子を利用し、不活化されている正常MECP2を発現させ治療することを検討する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、MECP2関連疾患であるRett症候群の遺伝子治療開発を目的としている。Rett症候群は女児に発症しMECP2の変異により生じるが、MECP2の重複男児でも重度知的障害、難治性てんかんを発症する。すなわちRett症候群の遺伝子導入治療ではMECP2の発現が過剰であっても機能異常を来すため、導入する遺伝子の発現量を調節する方法や別の方法の開発が不可欠である。昨年度は、Rett症候群のモデル動物であるMecp2欠損マウスのヘテロ雌及びヘミ雄の繁殖を開始し、初年度に作成したRett症候群に対する遺伝子治療用のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを投与した。運動障害等の評価の改善、組織や神経細胞の変化を観察を継続している。本年度は、MECP2発現量の抑制コントロール法の検討としてMECP2関連疾患のMECP2重複症候群で、micro RNA(miRNA)を応用したMECP2の発現を抑制する方法について検討しており、神経形成の研究の中でも特にmiRNAの知識が豊富であるBalor College of Medicineの海外共同研究者、Ronald Parchem博士の所属する研究室にて、申請者が2022年7月より研究を行いmiRNAに関する指導を受けている。特に、MECP2をターゲットとするmiRNAの一つであるmiR302は神経発生に大きく関与するmiRNAで、ノックアウトにより神経管の閉鎖が障害されマウスは胎生致死となるが、miR302のヘテロ接合性欠損マウスは生存可能であり、発現量に依存して神経発生に与える影響が変わることが示されており、miR302が神経発生に影響を与える機序の解明も含め、MECP2重複症候群においてMECP2の発現を抑制する方法として検討している。また、現在行っている疾患モデルマウスの検討とともに、患者細胞由来のヒト組織の両面で治療評価を行うために、脳オルガノイドを再現性を保ちつつ作成する手法の検討を行っている。今後、患者iPS細胞を用い、神経細胞や脳オルガノイドを作成し、中枢神経系の評価系を確立していく見込みである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は遺伝子治療用ベクターをRett症候群のモデル動物であるMecp2欠損マウスに投与する段階に進み、Mecp2欠損マウスで遺伝子治療用ベクターを投与し、生存期間や行動実験による評価を行い、本年度も継続的に観察している。さらに本年度は脳オルガノイドの作成について、まずは再現性の得られる手法の検討のためiPS細胞を用いた検討に入っており、今後、疾患ES細胞や患者iPS細胞を用いた実験を開始する。miRNAを用いるための知識、技術については、MECP2をターゲットとするmiRNAの一つであるmiR302のノックアウトマウスや、Wnt1、Sox1などの脳神経発生マーカーを利用した数種類のCREマウスを用いて順調に習得が進んでいる。他にも、ES細胞やiPS細胞からの神経細胞への分化、miR302と関連するmiR290など数種類のmiRNAに関する知識や実験を習熟した研究者らから指導を受けており、概ね順調に実施ができていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子治療用AAVベクター投与後のMecp2欠損マウスでの生存期間やロータロッド試験、オープンフィールド試験、スリーチャンバー試験などの運動障害等の評価、観察を継続するとともに、組織や神経細胞の変化の解析を進める。また、今後はmiRNAを用いた遺伝子発現調節機構の開発と、患者iPS細胞由来神経細胞を用いた中枢神経の治療評価系の構築をすべく、MECP2重複症候群の患者iPS細胞を用いて脳オルガノイドを作成するとともに、miR302をはじめとするmiRNAを利用した重複抑制による治療の開発を目指す。既存のmiRNAがMECP2に与える影響を調べながら、まずはMECP2重複症候群を対象として、遺伝子特異的なmiRNAを設計することも検討しつつMECP2遺伝子の発現抑制から調節を試みる。疾患モデルマウスと並行してMECP2重複症候群患者由来の培養細胞から作成した脳オルガノイドで中枢神経系に対する評価を行っていく。また引き続き患者iPS細胞由来の神経細胞の変化やX染色体不活性化因子等がMECP2に与える影響についても検討し、核酸医薬(SiRNA、アンチセンスオリゴ等)や遺伝子編集技術を応用したdCAS9の融合による複合的な方法により、正常遺伝子の発現レ ベルの制御可能なAAVベクターの構築すべく設計の工程を進めていく。
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