| 研究課題/領域番号 |
20K17043
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分53010:消化器内科学関連
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
横尾 健 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (80750629)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2021年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2020年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | ccndbp1 / chk1 / chk2 / DNA損傷チェックポイント |
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| 研究開始時の研究の概要 |
CCNDBP1は肝発癌との関連が報告されている。申請者はCCNDBP1がDNA損傷チェックポイント機構の制御因子として機能し肝発癌に関与すると推測した。本研究では、in vitro、ex vivo、 in vivoでCRISPR/Cas9システムを用いてChk1、Chk2をノックアウト(KO)し、 DNA損傷CP機構関連遺伝子群の発現変化と肝発癌の検証を行う。DNA損傷CP機構は肝発癌発生過程のドライバー遺伝子のひとつであり、CCNDBP1関連の発癌メカニズム解明により早期診断・治療効果予測のバイオマーカー発見や新規肝癌治療薬開発への寄与が期待される。
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| 研究実績の概要 |
実験の効率化と再現性の担保のために、各種ターゲットのsgRNAの設計の見直し、トランスフェクション試薬や暴露時間の変更、SCR7添加、Puromycinの濃度設定などの条件を再検討することにより、遺伝子改変効率を改善することに成功した。この方法をベースにして、in vitroでの解析を進めている。細胞株は、非癌肝細胞と肝癌細胞の両方を用いている。マウス肝由来ではAML12細胞株でchk1をターゲットとしてノックアウトを行うことにより細胞生存率の低下を認めた。AML12株での再現性を確認するとともに、ヒトの非癌幹細胞株であるTHLE-2でも検証を行っている。chk2、ccndbp1のノックアウト実験も進めており、細胞増殖に対する反応性を検証している。少なくともchk1をノックアウトした細胞株の増殖が当初の予想に反して悪いため、免疫不全マウスへの移植実験は困難と判断した。並行して、肝癌細胞株での検証として、マウス由来のHep-55.1C、ヒト由来のHLEならびにHuH7を用いて、遺伝子発現レベルの網羅的解析をスタートしており、複数種の肝癌細胞株におけるchk1、chk2、ccndbp1の発現状況について、cell cycleのpathwayにフォーカスして解析を進めている。in vitroの結果とあわせて、ccndbp1とDNA損傷チェックポイント機構における肝発癌における関与についての考察を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでの結果を受けて、免疫不全マウスへの細胞移植を断念し、遺伝子改変細胞株ならびに遺伝子改変マウスを中心とした解析に計画を修正した。修正後の計画の中では、概ね予定通りに解析を進めているが計画の延長を加味して、やや遅れている、とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
非癌肝細胞株、肝癌細胞株の網羅的遺伝子発現解析などを利用して、chk1、chk2、ccndbp1に関連するcell cycleの解析を進め、ccndbp1とDNA損傷チェックポイント(CP) 機構の肝発癌における関与を明らかにする。
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