研究課題/領域番号 |
20K17257
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研究種目 |
若手研究
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配分区分 | 基金 |
審査区分 |
小区分53040:腎臓内科学関連
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研究機関 | 岡山大学 (2021-2022) 東海大学 (2020) |
研究代表者 |
田中 景子 岡山大学, 大学病院, 助教 (80794370)
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研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2020年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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キーワード | ポドサイト / 血小板 / Podoplanin / CLEC-2 / 腎臓 |
研究開始時の研究の概要 |
Podoplaninは腎糸球体ポドサイトの細胞膜に強く発現するが、その機能は不明である。Podoplaninの内因性結合分子は、血小板に発現するC-type lectin like receptor-2(CLEC-2)である。正常時、ポドサイトは糸球体基底膜により血小板から隔絶されているが、基底膜傷害時に血小板や血漿中の可溶性CLEC-2がポドサイトに作用する事が考えられた。本研究計画では、in vitroおよびin vivoでCLEC-2がPodoplaninを介してポドサイトに与える影響を評価し、CLEC-2の傷害ポドサイトへの効果を明らかにする。
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研究実績の概要 |
Podoplaninは腎糸球体ポドサイトの細胞膜に強く発現するが、その機能は不明である。Podoplaninの内因性結合分子は、血小板に発現するC-type lectin like receptor-2(CLEC-2)である。正常時、ポドサイトは糸球体基底膜により血小板から隔絶されているが、基底膜傷害時に血小板や血漿中の可溶性CLEC-2がポドサイトに作用する事が考えられた。 リコンビナントCLEC-2を作製し、in vitroおよびin vivo実験を行った。in vitro実験では、FcおよびFc-CLEC-2で培養ポドサイトを刺激する実験を行った。Fcコントロールに比較し、Fc-CLEC-2刺激では、ポドサイトのアクチン線維が減少し、細胞突起は収縮し、細胞接着能の低下と遊走能の向上をみとめた。また、Podoplaninとアクチン線維をつなぐ介在蛋白ERMの脱リン酸化をみとめた。in vivo実験のために、より小分子のStrepTagII-FLAGタグCLEC-2(約30kDa)の発現Vectorを作製し大量精製した。正常マウスに投与したところ、FLAG-CLEC-2の糸球体への接着を確認でき、糸球体のRNA解析でSerpine1の上昇をみとめ、電顕像でポドサイトの足突起の退縮をみとめた。糸球体LysateのWestern Blotと蛍光染色では、Ezrinの脱リン酸化をみとめた。 以上より、血小板分子CLEC-2は、糸球体傷害時にポドサイトに発現するPodoplaninに結合し、介在蛋白Ezrinの脱リン酸化により、 Podoplaninからアクチンを乖離させ、アクチン線維の収縮を起こし、その結果ポドサイトは形態変化をおこし、遊走能を獲得することが明らかになった。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CLEC-2によるin vivoポドサイトの変化は予測より軽微であり、予定していたポドサイト傷害NEP25マウスでは、そのポドサイト傷害度を上回るCLEC-2の効果を期待するのは困難であると判断した。別のポドサイト傷害モデルマウスを準備し、予定していた研究をすすめる予定である。
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今後の研究の推進方策 |
CLEC-2のin vivo傷害ポドサイトへの効果を動物実験で検証する。 アドリアマイシン腎症マウスやストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルマウスを利用する。CLEC-2蛋白投与により、ポドサイト傷害が軽減されるのか、アルブミン尿や組織傷害度で評価する。
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