| 研究課題/領域番号 |
20K20495
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| 研究種目 |
挑戦的研究(開拓)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
超高齢社会研究
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| 研究機関 | 千葉大学 (2022)
東京大学 (2020-2021) |
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研究代表者 |
藤橋 浩太郎 千葉大学, 医学部附属病院, 特任教授 (50820354)
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| 研究分担者 |
中橋 理佳 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (80391887)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)
2022年度: 9,100千円 (直接経費: 7,000千円、間接経費: 2,100千円)
2021年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円)
2020年度: 9,100千円 (直接経費: 7,000千円、間接経費: 2,100千円)
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| キーワード | 記憶免疫 / CpG ODN / Flt3リガンド / 粘膜IgA / 老化 / Foxp1 / アジュバント / 肺炎球菌 / 分泌型IgA / 粘膜免疫 / メモリー免疫応答 / ダブルシグナル / ワクチン |
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| 研究開始時の研究の概要 |
高齢者の弱減化しているメモリー粘膜免疫力を向上させ、多種多様な呼吸器感染症から宿主を防御するための抗原非依存型広範囲呼吸器感染予防ワクチン開発の基盤構築を目的とする。肺炎球菌では多くの血清型が存在し、既存の肺炎球菌ワクチンではカバーできない血清型置換が問題となっている。この観点から、マウスモデルを用いて、樹状細胞(DCs)を標的としたダブルシグナルシステム(CpG ODNとFlt3リガンドcDNAプラスミドの併用, CpG/pFL)の経鼻投与によって、弱減化しているメモリー粘膜免疫力を再活性化させ、肺炎球菌感染症を予防する。
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| 研究実績の概要 |
老化による免疫力(ワクチン効果)の低下は肺炎球菌が原因である呼吸器感染症増加による、高齢者の死因に繋がっている。肺炎球菌では多くの血清型が存在し、既存の肺炎球菌ワクチンではカバーできない血清型置換が問題となっている。さらなる問題点は現在ライセンス化されている注射型ワクチンでは呼吸器感染症を防ぐ上で重要な役割を担っている粘膜防御[抗原特異的分泌型(S)IgA抗体]が期待できず、免疫力が低下している高齢者では十分な予防効果を発揮できないことである。そこで、細菌やウィルスの抗原に依存しない、申請者らが開発した樹状細胞(DCs)を標的としたダブルシグナルシステム(CpG ODNとFlt3リガンドcDNAプラスミドの併用, CpG/pFL)の経鼻投与によって、高齢者の弱減化しているメモリー粘膜免疫力(既存抗原特異的SIgA抗体)を向上させ、多種多様な呼吸器感染症から宿主を防御するための抗原非依存型広範囲呼吸器感染予防ワクチン開発の基盤構築を本研究申請の目的とする。本年度は、PspAとコレラ毒素(CT)をC57BL/6マウスに経鼻免疫し、約6ヶ月後に抗体価の減少が認められたので、ダブルシグナルシステムのみ（抗原を含まない）（CpG/pFL,実験群）を経鼻投与したところ、４週間後にPspA特異的IgA抗体価の上昇が鼻洗浄液中及び血清中に認められた。これは、PspA+ CTを用いて経鼻ブースターをした群とほぼ同程度の抗体価だった。そこで、これらのマウスに肺炎球菌(A66.1)を致死量(5 x 106/マウス)感染させたところ、ダブルシグナルシステム群では全てのマウスが7日後も生存していた。これらの実験データは本研究の中枢課題を明らかにするものであり、重要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
令和４年度、当初から東京大学医科学研究所から、千葉大学病院・ヒト粘膜ワクチン学部門へ移動となった。新型コロナの影響による半導体不足伴い、千葉大学側の動物実験施設の整備が遅れ、稼働開始が令和4年10月になった。この間、マクスの飼育ができず、記憶免疫誘導のためのマウスを維持することも不可能になった。また、作成したタモキシフェン誘導型CD4-Foxp1KOマウスは生体での移動ができず、凍結胚保存することになった。このように約半年間、動物実験できなかったため、全体の研究計画に大きな遅れが生じた。
ダブルシグナルシステム（CpG/pFL,実験群）の経鼻投与によりPspA特異的免疫応答が鼻洗浄液中と血清に誘導されていることが明らかになった。そこで、これらのマウスに肺炎球菌(A66.1)を致死量(5 x 106/マウス)感染させたところ、ダブルシグナルシステム群では全てのマウスが7日後も生存して、感染防御が成立していることが明らかになった。
現在、新たな記憶免疫の誘導を目的とし、PspA + CTを１週間ごとに３回経鼻免疫を行い、最終免疫から１週間後にPspA特異的免疫応答が誘導されていることが確認できたため、３ヶ月後、６ヶ月後の抗体価の変化を確認中である。
タモキシフェン誘導型CD4-Foxp1KOマウスのコロニーを確立するため、現在凍結胚からタモキシフェン誘導型CD4-Creマウス、Foxp1floxマウスの生体を得て、これらを交配し、KOマウスのスクリーニング中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ダブルアジュバントシステムの経鼻投与のみで減弱化した記憶免疫が回復し、感染防御能が誘導されることを確認する。また、IgA欠損(IgAKO)マウスを用いて同様な致死量・経鼻肺感染および鼻腔内限局感染実験を行い、肺炎球菌特異的IgA抗体の役割を解析する。
ダブルシグナルシステムはポリクローナルに免疫細胞を刺激して慢性炎症反応、アレルギー反応、自己免疫抗体の誘導を起こす可能性がある。そこで、上記の実験でCpG/pFL経鼻投与後採取した鼻洗浄液、血清中の抗原非特異的IgG抗体、IgE抗体をELISA法にて測定する。また、炎症性サイトカイン(TNF-a,IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-17)、アレルギー性サイトカイン(IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-33)をマルチサイトカイン定量キット(AimPlex)にて測定する。さらに血清中の抗核酸抗体やリウマチ因子IgG,IgM抗体をLBIS ELISAキットを用いて測定する。PBSのみ経鼻投与を対照群として上記の抗体やサイトカインが異常に上昇していないことを確認する。顕著な上昇が認められた場合は、それが一過性であることを確認するため、投与後２、４、６週間後に同様な解析を行う。
CpG/pFL経鼻投与によって、若齢時にPspA+CTを経鼻免疫した老齢マウスのNALT CD4+T細胞によるFoxp1発現が抑制される事をFACS解析にて明らかにする。また、老齢マウスのNALTメモリーCD4+T細胞をコンジェニックマウスに移入し、その後、CpG/pFL経鼻投与を行い、移入細胞のFoxp1発現が抑制され活性化エフェクターCD4+T細胞へと分化することを明らかにする。解析や移入に十分な細胞が分離困難な場合は頸部リンパ節(CLNs)より細胞を分離する。
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