| 研究課題/領域番号 |
20K20568
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| 研究種目 |
挑戦的研究(開拓)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分38:農芸化学およびその関連分野
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| 研究分担者 |
村井 篤嗣 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (10313975)
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)
2022年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円)
2021年度: 9,490千円 (直接経費: 7,300千円、間接経費: 2,190千円)
2020年度: 8,710千円 (直接経費: 6,700千円、間接経費: 2,010千円)
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| キーワード | 表皮 / 低酸素誘導因子 / 羊水 / トランスグルタミナーゼ / ケラチノサイト / 表皮細胞 / タンパク質架橋化酵素 / 空気暴露 / 気相培養 / 角化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生体の他の組織と同様に、皮膚表皮も細胞を体外で培養して再現できる。その際、未分化な細胞を、底面より培地を供給しつつ細胞の上層においては培地を極力除いた状態にする「空気暴露」が分化に必須である。この理由は不明であり、そのメカニズムを解明するため、空気暴露した細胞の中で何が起るのか、発現される遺伝子やタンパク質を明らかにする。
一方、空気に暴露されなくても羊水の中で育つ胎児は表皮が形成される。これは上の事実と矛盾し、何らかの表皮分化促進因子が羊水中にあると考えた。実際に羊水中には培養表皮細胞の分化を促進させる物質が存在することを見出したため、羊水から該当するタンパク質性因子を精製同定する。
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| 研究実績の概要 |
本課題では未分化な表皮細胞を立体的に培養することで、表皮組織に極めて近い構造へ達する再現系を対象に表皮分化の新しい制御機構について調べることを目的としている。これは、分化をする際に細胞を空気に暴露するという特殊な操作が必須である点に着目してのメカニズム解明をめざすアプローチである。この着想から同時に、空気に暴露されずとも表皮分化が生じる胎児の生育環境である「羊水」を給原にして、表皮細胞分化を促進する因子を精製同定してその活用を狙ったものである。
前者の課題についてはこれまでに、空気暴露の操作で、低酸素誘導因子（HIF）が変動して分化を制御することを見出している。この転写因子が、従来の低酸素刺激に応じて作用する遺伝子群ではなく、分化のシグナルを動かす別の遺伝子制御を担う仮説を立て、クロマチン免疫沈降法(Chip-seq)を行うべく、探索に向けた条件設定を行った。さらに並行して、液相培養(空気暴露をしない場合)であっても、振とう操作を施せば、分化が回復するという発見を果たした。実際に分化がどの程度回復するのかを、遺伝子発現パターンの比較を行うと共に、低酸素環境を設定した実験についても予備的検討を進めた。一方、羊水からの表皮細胞分化促進因子については、ヤギ、マウス、トリ(卵)を給原に精製を進めており、これまでにマウスとヤギについて候補となる分子を同定した。トリについては、胎生日数の異なる羊水に、精製同定に向けて分化刺激を検討してその構成分の違いを調べている段階である。また、これらの分子を動物細胞において、組換えタンパク質として生産するための実験系を打ち立てる事も完了することができた。今後精製同定を進めつつ候補因子の分化促進能を最終年度として検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
以下、２つに分けて記載する（１）細胞培養系において空気暴露が表皮分化刺激を与えるメカニズムの解明：ヒト表皮細胞の立体培養系を対象にして、空気暴露のしくみが低酸素誘導因子（HIF）の発現量と転写促進活性化能の変動によって支配されうることを、学術論文発表を行う目的もあったため、さらに詳細に条件検討した（学術論文の採択とオンライン発表に至った）。また、このターゲットになる新しい遺伝子配列を探るべく、クロマチン免疫沈降法(CHIP-Seq)を行うために、核からの染色体画分抽出を検討した。すでに広く確立されている手法ではあるが、分化段階の異なる細胞からの抽出については、最適な条件検討が難しく時間を費やした。しかし結果として十分な抽出方法を見出し、探索をできる状況にある。
（２）羊水由来の表皮分化促進因子の精製同定と性状解析：これまでの知見を活かして、有効な精製方法を見出していたので、大量のマウスおよびヤギ羊水からの精製を試みた。多段階のクロマトグラフィーによって精製を行い、質量分析によって候補となる因子の同定を行い、昨年度までの結果よりも多くの確実な候補因子を得た。また今後この因子の遺伝子組換え体を作製するシステムを確立することも併せて進めている。現在いくつかの組換え体を得ることに成功しており、今後、発現量を上昇させる方向を検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
空気暴露が刺激となる立体培養系における表皮細胞の分化促進機構を、転写因子としてのHIF(低酸素誘導因子)の異なるターゲット遺伝子配列への作用を想定して解析を進めていく。現在、探索を進める段階になっており、これを行う。また、低酸素が分化の制御因子であることが判明し、振とう培養で空気暴露がなくても分化促進の方向へ向かわせることを我々が初めて見出したので、今年度はその詳細な誘導パターン、また酸素添加のみがこの誘導に関わるのかを、トランスクリプトーム（遺伝子変動）解析によって調べる。
羊水については、マウスおよびヤギについて、これまでに精製同定を行っていくつかの候補タンパク質を同定出来ているが、昨年度により大量に羊水を調製したのでこれを基に精製段階を進めてより精度の高い結果を得たい。そのため、これらの精製を進めて質量分析によって候補を絞りたい。同時に、これまで得た候補タンパク質のいくつかを対象にして、動物細胞での有効な(分泌または可溶性になる)タンパク質を獲得する。得られたものは順次、表皮立体培養系、特に分化が生じない液相培養系に添加することによって、羊水内での表皮分化が再現できることを期待して解析を進める。
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