CRISPRを用いた新規ゲノム改変技術の開発

• 研究課題/領域番号: 20K20579
• 研究種目: 挑戦的研究(開拓)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
• 研究期間 (年度): 2020-07-30 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円); 2022年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円); 2021年度: 7,800千円 (直接経費: 6,000千円、間接経費: 1,800千円); 2020年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
• キーワード: CRISPR / Cas12k

研究開始時の研究の概要

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNA結合タンパク質Cas12kは、Tn7様トランスポゾン因子とCAST複合体を形成し、ドナーDNAをターゲットDNAの特定の位置に挿入する機能をもつ。本研究課題では、CAST-DNA超分子複合体の立体構造を決定し、DNA転移メカニズムを原子レベルで解明する。さらに、構造情報を利用することにより、効率的なノックイン技術の開発を目指す。

研究実績の概要

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。一方、最近発見されたCas12kはガイドRNAと複合体を形成し、ガイド配列と相補的な2本鎖DNAに結合する。Cas9と異なり、Cas12kはDNA切断活性をもたず、Tn7様トランスポゾン因子（TnsB、TnsC、TniQ）とCAST（CRISPR-associated transposase）複合体を形成し、ドナーDNA中の特定のカーゴ配列をターゲットDNAに挿入する。既知のトランスポザーゼはターゲットDNAの様々な部位にドナーDNAのカーゴ配列を挿入するのに対し、CAST複合体はCas12k-ガイドRNAの結合部位から約60塩基下流の位置にカーゴ配列を選択的に挿入する。ドナーDNAの挿入部位はガイドRNAによって規定されるため、CASTを用いることによりDSBを引き起こすことなくゲノムの狙った位置へのノックインが可能であると期待されている。しかし、Cas12k、TnsB、TnsC、TniQは新規のタンパク質であるため、CASTによるDNA転移反応の分子メカニズムは謎に包まれていた。本年度は、Cas12k、ガイドRNA、標的DNA、TniQ、TnsC、TnsBを混合することにより複合体を再構成し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-TniQ-TnsC複合体、および、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-TniQ-TnsC-TnsB複合体の立体構造の決定に成功した。さらに、新規のCRISPR複合体であるCas7-11-Csx29の構造機能解析に成功した。

研究成果

• [国際共同研究] MIT(米国)
• [国際共同研究] Broad Institute(米国)
• [雑誌論文] Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme (2021)
  • 著者名/発表者名: Takeda Satoru N.、Nakagawa Ryoya、Okazaki Sae、Hirano Hisato、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 81 号: 3 ページ: 558-570.e3
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2020.11.035
  • 査読あり
• [雑誌論文] Publisher Correction: Base editors for simultaneous introduction of C-to-T and A-to-G mutations (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakata Rina C.、Ishiguro Soh、Mori Hideto、Tanaka Mamoru、Tatsuno Kenji、Ueda Hiroki、Yamamoto Shogo、Seki Motoaki、Masuyama Nanami、Nishida Keiji、Nishimasu Hiroshi、Arakawa Kazuharu、Kondo Akihiko、Nureki Osamu、Tomita Masaru、Aburatani Hiroyuki、Yachie Nozomu
  • 雑誌名: Nature Biotechnology 巻: 38 号: 7 ページ: 901-901
  • DOI: 10.1038/s41587-020-0585-1
  • 査読あり