| 研究課題/領域番号 |
20K20582
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| 研究種目 |
挑戦的研究(開拓)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)
2025年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2024年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2023年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2022年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2021年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2020年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 多次元1細胞全ゲノム解析 / ゲノム増幅法 / scRepli-seq / scHi-C / Dip-C |
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| 研究開始時の研究の概要 |
最近、我々は1細胞全ゲノムDNA複製解析技術であるscRepli-seq法の開発に成功した。独自の基盤技術であるscRepli-seq法の解像度をさらに向上できれば、これまで我々の目に見えていなかったDNA複製制御様式の発見や、局所的な欠失や増幅等のゲノム変異同定の研究に大きなインパクトを及ぼす。また、scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析を実現すれば、DNA複製研究の枠を超えて、ゲノム・染色体研究全般に大きな波及効果をもたらすことが期待できる。そこで、本研究では、scRepli-seqの解像度の飛躍的向上と、これを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現を目指す。
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| 研究実績の概要 |
我々独自の1細胞全ゲノムDNA複製解析技術であるscRepli-seq法を更に発展させるべく、本研究は（１）scRepli-seqの「第二世代化」による解像度の飛躍的向上、（２）scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現、の二つを目的としている。（１）に関して、我々のscRepli-seq法が採用しているのは指数関数的ゲノム増幅法（DOP-PCR）だが、DOP-PCRの工程を変更して線形あるいはそれに類似のゲノム増幅法にするとscRepli-seqの解像度をさらに向上させられると考え、線形ゲノム増幅法であるLIANTI（Science, 2017）という手法を採用して試行錯誤を繰り返したがLIANTI法は断念した。他のいくつかのゲノム増幅法を試しているが、希望の持てる予備データが出つつある。（２）に関しては大きな進展がいくつかあり、同一細胞からscRepli-seqと1細胞RNA-seq（scRNA-seq、正確にはscRamDA-seq; Hayashi et al., Nature Commun, 2018）を同時実現出来る１細胞全ゲノム解析技術が完成して論文を投稿しており、論文の完成に向けて鋭意取り組んでいる。これと並行して1細胞Hi-C（scHi-C）解析のプロトコール確立にも取り組み、文字通り1細胞から開始して質の高いscHi-Cデータを得ることに成功した。現在、ゲノム増幅法の検討を通じて、さらなるscHi-Cデータの品質向上を目指している。また、scHi-CとscRepli-seqの同時実現に向けた検討も進めており、最終的には、scRNA-seq・scRepli-seq・scHi-Cの三者を同時に解析可能とする条件の確立をめざす。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は（１）scRepli-seqの「第二世代化」による解像度の飛躍的向上、（２）scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現、の二つを目的としている。（１）に関して、現在、我々のscRepli-seq法が採用しているのは指数関数的ゲノム増幅法（DOP-PCR; Degenerate oligonucleotide-primed PCR）だが、DOP-PCRの工程を変更して線形あるいはそれに類似のゲノム増幅法にすると目的を達成できると考えている。これまでは、線形ゲノム増幅法LIANTI（Science, 2017）を試して試行錯誤を繰り返していたが、現在までのところ、我々の手ではうまく再現できておらずLIANTI法は断念することにした。現在、他のいくつかのゲノム増幅法を検討中で、引き続きこちらの方向で進めている。（２）に関しては大きな進展がいくつかあり、同一細胞からscRepli-seqと1細胞RNA-seq（scRNA-seq、正確にはscRamDA-seq; Hayashi et al., Nature Commun, 2018）を同時実現出来る１細胞全ゲノム解析技術が出来つつあり、現在、論文完成に向けて取り組んでいる。並行して、1細胞Hi-C（scHi-C）解析プロトコールも確立し、1細胞からの高品質なデータ取得に成功した。さらなる品質向上を目指し、ゲノム増幅法の検討も進めている。現在はscRNA-seqとの同時実現に向け、細胞溶解バッファー組成を検討しつつプロトコール最適化を進めている。また、scHi-CとscRepli-seqの同時実現に向けた解析技術の開発も進め、最終的にscRNA-seq・scRepli-seq・scHi-C三者を同時解析できる条件の確立を目指している。（１）（２）ともに「おおむね順調に進展している」という自己評価である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）scRepli-seqの「第二世代化」による解像度の飛躍的向上、については、次年度も引き続き、scRepli-seq法の工程にあるゲノム増幅法を、線形ゲノム増幅法あるいは準線形の手法に変更する試みを続ける。候補となる手法を絞り込んで最適化を進めている。（２）scRepli-seqを起点とした多次元1細胞全ゲノム解析の実現、については、同一細胞からscRepli-seqと1細胞RNA-seq（scRNA-seq）を同時実現することは達成できたので、論文完成に向けて取り組む。加えて、1細胞Hi-C（scHi-C）のさらなる品質向上に向け、ゲノム増幅法の検討を通じて、ゲノムカバー率を含むデータ出力の向上に取り組む。並行して、scHi-CとscRepli-seqの同時実現に向けた解析技術の確立にも注力する。さらに、scHi-CとscRNA-seqの同時実現に関しては、細胞溶解バッファーの組成を複数検討しながら、プロトコールの最適化を図る。これらの取り組みにより、scRNA-seq・scRepli-seq・scHi-Cの三者を同一細胞から同時に解析可能とする、多次元1細胞全ゲノム解析の実現を推進していきたい。
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