| 研究課題/領域番号 |
20K20591
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| 研究種目 |
挑戦的研究(開拓)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分47:薬学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
袖岡 幹子 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (60192142)
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| 研究分担者 |
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (20415243)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)
2022年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2021年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2020年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
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| キーワード | アフィニティー精製 / タグ / 修飾ペプチド / 遷移金属 / パラジウム |
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| 研究開始時の研究の概要 |
アフィニティーラベリングによる生物活性分子の標的タンパク質や結合部位の決定は、生物活性分子にタグを導入し、修飾されたタンパク質やそれを酵素消化して得られるペプチドを検出・同定することによって行われる。しかし多量の非修飾ペプチドの共存下で目的とする修飾ペプチドを同定することは容易ではない場合も多く、同定の効率化のためには、タグをつけた生物活性分子でラベルされたペプチドの効率的な精製が必要となる。本研究では、遷移金属化学を利用した新しいタグ分子の精製技術を開発する。
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| 研究実績の概要 |
アフィニティーラベリングによる生物活性分子の標的タンパク質や結合部位の決定は、生物活性分子にタグを導入し、修飾されたタンパク質やそれを酵素消化して得られるペプチドを検出・同定することによって行われる。しかし多量の非修飾ペプチドの共存下で目的とする修飾ペプチドを同定することは容易ではない場合も多く、同定の効率化のためには、タグを導入した生物活性分子でラベルされたペプチドを効率的に精製することが必要となる。一般的にはアルキンタグを標的化合物に導入し、クリック反応でアルキンにビオチンを導入したのちに精製を行うが、クリック反応後の精製操作でサンプルをロスしたり、導入したビオチンがペプチドを不溶化させたり、イオン化効率を悪くさせたりすることなどが問題としてあげられる。そこで本研究では遷移金属化学を利用することで、クリック反応などを用いずに直接タグ分子を精製する技術を開発する。
本年度は昨年度検討したタグと遷移金属錯体の組み合わせに関して、引き続き検討を進めた。昨年度の検討を生かし、タグを導入した化合物により標的とする蛋白質を細胞内で標識し、抽出した蛋白質混合物から酵素消化でペプチド断片混合物を調製した。これを固相担体に固定化した金属錯体を用いて捕捉・濃縮することを試みた結果、目的とするペプチド断片を濃縮し、検出することに成功した。一方で本年度は、並行して昨年度とは異なるタグおよび金属錯体の組み合わせも検討し、こちらでもタグで標識されたペプチドの捕捉に成功した。新たなタグに関しては共有結合型の酵素阻害剤に導入し、酵素と共有結合を形成した後に、修飾部位を含むペプチド断片を捕捉・濃縮できることも確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は昨年度見出したタグおよび遷移金属錯体の組み合わせを用いて、細胞内で修飾されたペプチド断片を濃縮することにも成功した。さらに並行して新しいタグと遷移金属錯体の組み合わせにも挑戦し、新しいタグでも酵素阻害剤の結合ペプチドを濃縮することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
２つのタグに関して、それぞれ目的とする濃縮効果が見られたことから、それぞれに関して論文化を進めている。
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