| 研究課題/領域番号 |
20K20591
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| 研究種目 |
挑戦的研究(開拓)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
中区分47:薬学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
袖岡 幹子 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (60192142)
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| 研究分担者 |
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (20415243)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
26,000千円 (直接経費: 20,000千円、間接経費: 6,000千円)
2022年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2021年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
2020年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
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| キーワード | アフィニティー精製 / タグ / 修飾ペプチド / 遷移金属 / パラジウム |
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| 研究開始時の研究の概要 |
アフィニティーラベリングによる生物活性分子の標的タンパク質や結合部位の決定は、生物活性分子にタグを導入し、修飾されたタンパク質やそれを酵素消化して得られるペプチドを検出・同定することによって行われる。しかし多量の非修飾ペプチドの共存下で目的とする修飾ペプチドを同定することは容易ではない場合も多く、同定の効率化のためには、タグをつけた生物活性分子でラベルされたペプチドの効率的な精製が必要となる。本研究では、遷移金属化学を利用した新しいタグ分子の精製技術を開発する。
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| 研究実績の概要 |
アフィニティーラベリングによる生物活性分子の標的タンパク質や結合部位の決定は、生物活性分子にタグを導入し、修飾されたタンパク質やそれを酵素消化して得られるペプチドを検出・同定することによって行われる。しかし多量の非修飾ペプチドの共存下で目的とする修飾ペプチドを同定することは容易ではない場合も多く、同定の効率化のためには、タグを導入した生物活性分子でラベルされたペプチドを効率的に精製することが必要となる。一般的にはアルキンタグを標的化合物に導入し、クリック反応でアルキンにビオチンを導入したのちに精製を行うが、クリック反応後の精製操作でサンプルをロスしたり、導入したビオチンがペプチドを不溶化させたり、イオン化効率を悪くさせたりすることなどが問題としてあげられる。そこで本研究では遷移金属化学を利用することで、クリック反応などを用いずに直接タグ分子を精製する技術を開発する。
本年度は昨年度見出した新たなタグとしてコンパクトなβ-ケトアミドを用いて、パラジウム錯体を固定化したビーズで捕捉する手法の開発を進め、論文化することに成功した。具体的にはβ-ケトアミド構造を共有結合型のプロテアーゼ阻害剤に導入し、その標的とするプロテアーゼの結合部位同定に挑戦した。パラジウム錯体を固定化したビーズに対して、β-ケトアミドタグを効率的に結合させると共に非特異的に結合するペプチドを極力減らすため、溶媒や反応条件など種々検討を行い、最終的に結合部位を含むペプチド断片を捕捉し、質量分析装置による解析で同定することに成功した。またこの際にパラジウムビーズとβケトアミドタグとの間の結合定数なども測定し、効率的に精製するために必要な条件も明らかにした。
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