| 研究課題/領域番号 |
20KK0373
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| 研究種目 |
国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分54040:代謝および内分泌学関連
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
佐久間 一基 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任准教授 (70791721)
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| 研究期間 (年度) |
2021 – 2023
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
14,040千円 (直接経費: 10,800千円、間接経費: 3,240千円)
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| キーワード | 非アルコール性脂肪性肝疾患 / 糖尿病 / インスリン抵抗性 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究の目的は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)における肝鉄蓄積とインスリン抵抗性増大を結びつけるメカニズムを、肝代謝フラックス解析システムを用いて解明することである。申請者が確立したアデノウイルスベクターとCRISPR/Cas9を組み合わせた肝特異的FDXRノックアウトマウスの肝臓組織を用いてRNAシークエンスとプロテオーム解析を行う。また、共同研究者のYale大学Gerald Shulman教授が精通している肝代謝フラックス解析によって、肝鉄蓄積が糖代謝、脂肪酸合成、脂肪酸β酸化、ケトン合成に影響を及ぼす作用点を統合解析することで、新規NAFLD治療薬・糖尿病治療薬へ展開を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)における肝鉄蓄積とインスリン抵抗性増大を結びつけるメカニズムを、肝代謝フラックス解析システムを用いて解明することである。
アデノ随伴ウイルスをマウス尾静脈より投与して、ミトコンドリア鉄代謝調節分子FDXRの肝臓特異的過剰発現を行い、PINTA(positional isotopomer nuclear magnetic resonance tracer analysis)解析を行った。マウスに[3-13C]Lactate, [3-3H]Glucose 持続静注を行い、肝臓における各種代謝産物（標識/非標識）を測定し、TCA回路を担うクエン酸合成酵素（Vcs）と糖新生を担うピルビン酸カルボキシラーゼ(Vpc)のフラックス解析を行った。FDXR過剰発現マウスは、コントロール群と比較して、Vpc/Vcs比の低下、Vcsの上昇を認め、FDXRがmitochondrial oxidationを増加させることが示された。
次に、GalNAC修飾したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）による肝臓特異的FDXRノックダウンマウスを用いて、グルタミン酸代謝フラックス解析を行った。マウスに[13C5]glutamineと [3-3H]Glucose の持続静注を行い、肝臓における各種代謝産物（標識/非標識コハク酸、リンゴ酸、グルタミン、グルタミン酸）を測定した。FDXRノックダウンマウスは、コントロール群と比較して、コハク酸の標識産物のenrichmentが上昇を認める一方で、リンゴ酸、グルタミン、グルタミン酸のenrichmentには変化は認めなかった。以上から、FDXRノックダウンによりコハク酸デヒドロゲナーゼのフラックス低下とコハク酸蓄積が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
GalNAC-ASOによる肝臓特異的FDXRノックダウンマウスを用いて、肝代謝フラックス解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
FDXRの肝臓特異的ノックダウンマウスの検討で、FDXRはコハク酸デヒドロゲナーゼのフラックス低下とコハク酸蓄積が示唆された。同マウスモデルを用いて、ブドウ糖負荷試験、ピルビン酸負荷試験、グルコースクランプ試験で、耐糖能、糖新生、インスリン抵抗性を評価する。加えて、下記肝代謝フラックス解析を行う。
1.肝代謝フラックス解析:
コハク酸デヒドロゲナーゼはコハク酸→フマル酸の反応に加えて、逆方向（フマル酸→コハク酸）の反応も担うことが報告されている。グルタミン酸代謝フラックスに加えて、[13C4]aspartateを持続静注後の肝臓における各種代謝産物（標識/非標識コハク酸、リンゴ酸）を測定して、コハク酸デヒドロゲナーゼの両方向の反応を評価する。
2.LC/MS/MSを用いた肝臓での脂質プロファイルの同定:
肝インスリン抵抗性に関わるジアシルグリセロール、セラミド蓄積の有無、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性化による糖新生亢進をきたすアセチルCoA量を評価する。
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