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微生物叢ゲノム断片アイソトープアレイによる環境汚染物質分解微生物の特定技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号 21651028
研究種目

挑戦的萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 環境技術・環境材料
研究機関東京大学

研究代表者

栗栖 太  東京大学, 大学院・工学系研究科, 准教授 (30312979)

研究分担者 春日 郁朗  東京大学, 大学院・工学系研究科, 助教 (20431794)
研究期間 (年度) 2009 – 2010
研究課題ステータス 完了 (2010年度)
配分額 *注記
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2010年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2009年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
キーワード環境微生物 / アイソトープアレイ / ゲノム断片アレイ / 微生物群集解析 / メタゲノム
研究概要

本年度の研究では、ショットガンアレイにおいて1)さらに近縁な微生物種間の検出における特異性について検討するとともに、アイソトープアレイにおいて2)得られたシグナルが本当に基質を資化した微生物由来のシグナルであるかを検証した。
1)ショットガンアレイの特異性に関する検討については、同一の属(Pseudomonas属)に属し、互いの遺伝学的類似度が異なる4種の純菌株を用いた検討を行った。ゲノムDNAを断片化、クローニングを行い、1枚のメンブレンにスポットしたショットガンアレイを作成したのち、上記の純菌株由来のDNA断片をハイブリダイゼーションさせた。その結果、同属異種の菌株においては、高度に保存されているrrnオペロン配列では特異的な検出は不可能であるものの、そのほかの配列では条件を厳しくすることにより、特異的なシグナルを非特異的なものと比べ10倍以上の強度で得ることができることを明らかにした。
2)アイソトープアレイで得られるシグナルの検証
活性汚泥に対して放射性同位体標識した酢酸、メタノールを投与し、同一試料から抽出したDNAによるアレイとハイブリダイズさせて得られたシグナルのスポットについて、安定同位体プローブ法(SIP法)を用いて各基質を資化する微生物であるかどうかを検証した。5個の陽性プローブと4個の陰性プローブについて塩基配列を解読し、各塩基配列を用い、当該DNAの存在を定量的に測定できるプライマーを設計した。この特異的なPCRプライマーを用い、定量PCR法によりSIP法によって分離した各画分のDNAを定量し、標識基質のDNAへの取り込みを調べたところ、1つを除き検出結果が正しいことを検証した。この結果より、ショットガンアイソトープアレイ法が実際の微生物生態系において、基質を資化した微生物を特異的に検出できる手法であることを示すことができた。
以上の結果により、クロスハイブリダイゼーションによる誤陽性の可能性を明らかにするとともに最小限に抑えたうえで、アイソトープアレイによる実環境試料の解析例を、その信頼性とともに示すことができた。

報告書

(2件)
  • 2010 実績報告書
  • 2009 実績報告書
  • 研究成果

    (4件)

すべて 2011 2010 2009

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] 微生物叢ゲノム断片をプローブとするアイソトープアレイによる基質特異的微生物検出手法の〓2009

    • 著者名/発表者名
      飛野智宏, 栗栖太、春日郁朗、古米弘明
    • 雑誌名

      水環境学会誌 32

      ページ: 595-601

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] ショットガンアイソトープアレイ法を用いて活性汚泥中から基質特異的に探索した微生物の追跡2011

    • 著者名/発表者名
      飛野智宏, 栗栖太, 春日郁朗, 古米弘明
    • 学会等名
      第45回日本水環境学会年会講演集
    • 発表場所
      札幌市
    • 年月日
      2011-03-18
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] ショットガンアイソトープアレイ法で用いるランダムゲノム断片プローブの特異性の検討2010

    • 著者名/発表者名
      飛野智宏, 栗栖太, 春日郁朗, 古米弘明
    • 学会等名
      第26回日本微生物生態学会大会
    • 発表場所
      つくば市
    • 年月日
      2010-11-24
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] 微生物叢ゲノム断片プローブを用いたアイソトープアレイによる活性汚泥中の酢酸およびメタノール資化微生物の検出2010

    • 著者名/発表者名
      飛野智宏, 栗栖太, 春日郁朗, 古米弘明
    • 学会等名
      第44回日本水環境学会年会
    • 発表場所
      福岡大学
    • 年月日
      2010-03-17
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書

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公開日: 2009-04-01   更新日: 2016-04-21  

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