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Lys63結合型ポリユビキチン鎖を検出する分子プローブの開発とその応用

研究課題

研究課題/領域番号 21657031
研究種目

挑戦的萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 機能生物化学
研究機関東京工業大学

研究代表者

駒田 雅之  東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 准教授 (10225568)

研究期間 (年度) 2009 – 2010
研究課題ステータス 完了 (2010年度)
配分額 *注記
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2010年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2009年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
キーワードユビキチン / 脱ユビキチン化酵素 / タンパク質分解 / 分子プローブ / 癌 / 酵素 / 細胞・組織 / シグナル伝達 / タンパク質
研究概要

脱ユビキチン(Ub)化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリUb鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型Ub鎖と安定な複合体を形成することを具出している。本研究では、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオン・ビーズを用いて精製した。そして、このGST融合タンパク質をLys63結合型Ub鎖を特異的に認識する分子プローブとして利用することができないか、以下の2つの実験により検討した。
1.固定しpermeabilizeしたHeLa細胞をAMSH-GST融合タンパク質とインキュベートし、細胞内のLys63結合型Ub化されたタンパク質と結合させた。未結合のGST融合タンパク質を除いた後、抗GST抗体による免疫染色でLys63結合型Ub化された細胞内タンパク質の局在の同定を試みた。しかし、コントロール細胞と比べて強く染色される細胞内部位を見出すことはできなかった。用いるGST融合タンパク質の濃度やインキュベーションの温度、時間などの条件を細かく検討する必要が示唆された。
2.精製したAMSH-GST融合タンパク質をグルタチオン・ビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞のライセートを加えてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合タンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗Ub抗体でイムノブロッティングした。その結果、Ub化タンパク質のスメアーが検出された。このスメアーは、コントロールのGSTタンパク質によってはプルダウンされなかった。AMSH触媒ドメインはLys63結合型Ub鎖に特異的に結合することから、このドメインがHeLa細胞中でLys63結合型Ub化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。引き続き、この系をスケールアップして大量のLys63結合型Ub化タンパク質を調製し、プロテオーム解析によりそれらの網羅的同定を試みたい。

報告書

(2件)
  • 2010 実績報告書
  • 2009 実績報告書
  • 研究成果

    (27件)

すべて 2011 2010 2009 その他

すべて 雑誌論文 (15件) (うち査読あり 11件) 学会発表 (10件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor2011

    • 著者名/発表者名
      Hanafusa, H.
    • 雑誌名

      Nature Commun.

      巻: 2 ページ: 158-158

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Balanced ubiquitylation and deubiquitylation of Frizzled regulate cellular responsiveness to Wg/Wnt2010

    • 著者名/発表者名
      Mukai, A.
    • 雑誌名

      EMBO J.

      巻: 29 ページ: 2114-2125

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Dominant-negative mutations in α-II spectrin cause West syndrome with severe cerebral hypomyelination, spastic quadriplegia, and developmental delay2010

    • 著者名/発表者名
      Saitsu, H.
    • 雑誌名

      Am.J.Hum.Genet.

      巻: 86 ページ: 881-891

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Activated microglia mediate axo-glial disruption that contributes to axonal injury in multiple sclerosis2010

    • 著者名/発表者名
      Howell, O.W.
    • 雑誌名

      J.Neuropathol. Exp.Neurol.

      巻: 69 ページ: 1017-1033

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Involvement of a membrane skeletal protein, 4.1G, for Sertoli/germ cell interaction2010

    • 著者名/発表者名
      Terada, N.
    • 雑誌名

      Reproduction

      巻: 139 ページ: 883-892

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 脱ユビキチン化酵素群の細胞機能2010

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 雑誌名

      生化学

      巻: 82 ページ: 378-387

    • NAID

      10026425815

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 受容体のユビキチン化と脱ユビキチン化を介した細胞のWnt応答性の制御2010

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 雑誌名

      細胞工学

      巻: 29 ページ: 1237-1243

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [雑誌論文] 軸索に特異的なスペクトリン細胞膜骨格の機能2010

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 雑誌名

      生体の科学

      巻: 61 ページ: 498-499

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [雑誌論文] Involvement of a membrane skeletal protein, 4.1G, for Sertoli/germ cell interaction.2010

    • 著者名/発表者名
      Terada, N.
    • 雑誌名

      Reproduction 139(in press)

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 脱ユビキチン化酵素群の細胞機能2010

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 雑誌名

      生化学 82(印刷中)

    • NAID

      10026425815

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Nucleolar structure and function are regulated by the deubiquitylating enzyme USP36.2009

    • 著者名/発表者名
      Endo, A.
    • 雑誌名

      J.Cell Sci. 122

      ページ: 678-686

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Nucleophosmin/B23 regulates ubiquitin dynamics in nucleoli by recruiting deubiquitylating enzyme USP36.2009

    • 著者名/発表者名
      Endo, A.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 284

      ページ: 27918-27923

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Dispensable role of protein 4.1B/DAL-1 in adrenal medulla regarding generation of pheochromocytoma and plasmalemmal localization of TSLC1.2009

    • 著者名/発表者名
      Ohno, N.
    • 雑誌名

      Biochim.Biophys.Acta 1793

      ページ: 506-515

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 核小体の機能のユビキチンダイナミクスによる制御2009

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 雑誌名

      生体の科学 60

      ページ: 521-526

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [雑誌論文]2009

    • 著者名/発表者名
      赤池敏宏
    • 雑誌名

      バイオ研究のフロンティア3-医療診断をめざす先端バイオテクノロジー(工学図書)

      ページ: 59-67

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] Regulation of the deubiquitinating enzyme USP36 during mitosis2010

    • 著者名/発表者名
      遠藤彬則
    • 学会等名
      第33回日本分子生物学会/第83回日本生化学学会合同大会BMB2010
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2010-12-10
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] Nrk is a Ser/Thr kinase required for placental development and labor induction2010

    • 著者名/発表者名
      伝田公紀
    • 学会等名
      第33回日本分子生物学会/第83回日本生化学学会合同大会BMB2010
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2010-12-10
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] ANKRD13 family of ubiquitin-binding proteins are possibly involved in endocytosis of epidermal growth factor receptor2010

    • 著者名/発表者名
      丹野秀崇
    • 学会等名
      第33回日本分子生物学会/第83回日本生化学学会合同大会BMB2010
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2010-12-08
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] USP36, a nucleolar deubiquitinating enzyme2010

    • 著者名/発表者名
      Endo, A.
    • 学会等名
      第33回日本分子生物学会/第83回日本生化学学会合同大会BMB2010
    • 発表場所
      Cambridge, UK
    • 年月日
      2010-07-20
    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [学会発表] 核小体における脱ユビキチン化酵素USP36を介したヌクレオフォスミンによるユビキチン化制御2009

    • 著者名/発表者名
      遠藤彬則
    • 学会等名
      第32回日本分子生物学会大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2009-12-12
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] 核小体の機能のユビキチンダイナミクスによる制御2009

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 学会等名
      第32回日本分子生物学会大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2009-12-10
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] Placental overgrowth in mice lacking NESK, a novel Ser/Thr kinase of the Ste20 family.2009

    • 著者名/発表者名
      伝田公紀
    • 学会等名
      第32回日本分子生物学会大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2009-12-10
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] Balanced ubiquitylation and deubiquitylation regulate Frizzled degradation and cellular responsiveness to Wingless/Wnt.2009

    • 著者名/発表者名
      向井明子
    • 学会等名
      第32回日本分子生物学会大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2009-12-09
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] ユビキチン化/脱ユビキチン化によるWnt受容体Frizzledの分解とWntシグナリングの制御2009

    • 著者名/発表者名
      駒田雅之
    • 学会等名
      第82回日本生化学会大会
    • 発表場所
      神戸
    • 年月日
      2009-10-21
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [学会発表] Nucleophosmin/B23 regulates nucleolar ubiquitin dynamics by recruiting the deubiquitinating enzyme USP36.2009

    • 著者名/発表者名
      遠藤彬則
    • 学会等名
      第61回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      2009-06-03
    • 関連する報告書
      2009 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://www.kitamura-komada-lab.bio.titech.ac.jp

    • 関連する報告書
      2010 実績報告書
  • [備考]

    • URL

      http://www.kitamura-komada-lab.bio.titech.ac.jp/

    • 関連する報告書
      2009 実績報告書

URL: 

公開日: 2009-04-01   更新日: 2016-04-21  

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