停止複製フォーク結合タンパク質PriAを用いた染色体脆弱部位の探索

• 研究課題/領域番号: 21657036
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 正井 久雄 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 参事研究員 (40229349)
• 研究分担者: 田中 卓 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (80425686) ; 加納 豊 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90450593)
• 研究期間 (年度): 2009 – 2010
• 研究課題ステータス: 完了 (2010年度)
• 配分額: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2010年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2009年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
• キーワード: PriAタンパク / 複製フォーク / 染色体脆弱部位 / 染色体免疫沈降 / aphidicolin / ChIP-chip解析 / DNA複製停止 / DNAヘリカーゼ

研究概要

本研究では、大腸菌PriAタンパク質の「停止した複製フォークに選択的に強く結合する」という生化学的性質をtoolとして、複製が停止しやすいあるいはslow downする染色体脆弱部位を染色体上の複製が停止し易い領域あるいは、停止した際に適切に回復さない領域として網羅的に探索することを計画した。
動物細胞(がん細胞あるいは正常細胞)でPriAタンパクを発現し、正常に複製している状態あるいは低濃度のaphidicolinあるいはHU(ヒドロキシ尿素:複製阻害剤)で複製進行を阻害した場合にPriAタンパク質が結合するDNAを染色体免疫沈降法で濃縮し、同定する。期間内に、このシステムを構築し、複製停止部位をゲノムワイドで同定する。種々のヒト細胞でtag付きPriAをectopicに発現する細胞株を樹立し、tagに対する抗体を用いた染色体免疫沈降法により、沈降されるDNAを濃縮、増幅し、ゲノムタイリングアレイへのhybridizationあるいは網羅的塩基配列決定により、複製フォークの停止し易い領域をゲノムワイドで同定する計画である。本年度の成果は以下の通りである。
1 作製したPriAに対する特異抗体および付加したtagに対する抗体により、様々な細胞(ヒトがん細胞および正常細胞)に発現したPriAを免疫沈降できることを確認した。また、クロスリンクによる染色体免疫沈降条件下でも解析可能な効率で免疫沈降できることを確認した。マイクロアレイ解析に持ち込める染色体を沈降させるための条件検討を重ね、最適条件を決定した。
2 まず大腸菌をもちいて、染色体免疫沈降を行い、マイクロアレイによる検出を試みた。コントロールとして、PriA欠損株のほか、複製起点や複製中のフォークに存在するDnaBなど、複製装置を構成するタンパク質を利用した。これらの大腸菌のゲノム上に検出される各ピークの解析において、既存のソフトウェアでは結合イベントの妥当性を正確に見積もれなかったため、専用のアルゴリズムを作製し、現在検証中である。

研究成果

• [雑誌論文] Pre-firing binding of Mrcl defines the early-firing origins which are selectively hyper-activated upon loss of fork stabilizing factors in fission yeast. (2011)
  • 著者名/発表者名: Hayano, M., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Kakusho, N., Masai, H.
  • 雑誌名: Mol.Cell.Biol. 巻: 31 In press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient expression and purification of human replication fork-stabilizing factor, Claspin, from mammalian cells : DNA binding activity and novel protein interactions. (2011)
  • 著者名/発表者名: Uno, S, Masai, H.
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 16 In press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular mechanism of activation of human Cdc7 kinase : Bipartite inter action with Dbf4/ASK stimulates ATP binding and substrate recognition. (2011)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitamura, Rino Fukatsu, Naoko Kakusho, Yong-Soon Cho, Chika Taniyama, Satoshi Yamazaki, Gaik-theng Toh, Kazuo Yanagi, Naoko Arai, Ho-Jin Chang, Hisao Masai
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 巻: 286 In press
  • 査読あり
• [雑誌論文] RecQL4 : a helicase linking formation and maintenance of a replication fork. (2011)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biochem. 巻: 142 In press
  • NAID: 10030585512
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cdc7L1. (2011)
  • 著者名/発表者名: Toh G-T., Masai, H.
  • 雑誌名: UCSD-Nature Molecule Pages 巻: In press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fission yeast Swil-Swi3 complex facilitates DNA binding of Mrc1. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Yokoyama, M., Matsumoto, S., Fukatsu, R., You, Z., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 巻: 285 ページ: 39609-39622
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deregulated Cdc6 inhibits DNA replication and suppresses Cdc7-mediated phosphorylation of Mcm2-7 complex. (2010)
  • 著者名/発表者名: Kundu, L.R., Kumata, Y., Kakusho, N., Watanabe, S., Furukohri, A., Waga, S., Sekia, M., Masai, H., Enomoto, T., Tada, S.
  • 雑誌名: Nucleic Acid Res. 巻: 38 ページ: 5409-5418
  • 査読あり
• [雑誌論文] Casein kinase 2-dependent phosphorylation of human Rad9 mediates the interaction between human Rad9-Hus1-Rad1 complex and TopBP1. (2010)
  • 著者名/発表者名: Takeishi, Y., Ohashi, E., Ogawa, K, Masai, H., Obuse, C., Tsurimoto, T.
  • 雑誌名: Genes Cells 巻: 15 ページ: 761-771
  • NAID: 120005227474
  • 査読あり
• [雑誌論文] DDK phosphorylates checkpoint clamp Rad9 and promotes its release from damaged Chromatin. (2010)
  • 著者名/発表者名: Furuya, K., Miyabe, I., Tsutsui, Y., Paderi, F., Kakusho, N., Masai, H., Niki, H., Carr, A.M.(20
  • 雑誌名: Mol.Cell 巻: 40 ページ: 606-618
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cdc7-Mediated Rad18 Phosphorylation Directs the Accumulation of DNA Polymerase η at Sites of Stalled Replication. (2010)
  • 著者名/発表者名: Day, T.A., Palle, K., Barkley, L.R., Kakusho, N., Zou, Y., Tateishi, S., Verreault, A., Masai, H., Vaziri, C.
  • 雑誌名: J.Cell Biol. 巻: 191 ページ: 953-966
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hsk1 kinase and Cdc45 regulate replication stress-induced checkpoint responses in fission yeast. (2010)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, S., Shimmoto, M., Kakusho, N., Yokoyama, M., Russell, P., Masai, H.
  • 雑誌名: Cell Cycle 巻: 9 ページ: 4627-4637
  • 査読あり
• [雑誌論文] FANCs regulate firing of DNA replication origins. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.
  • 雑誌名: Cell Cycle 巻: 9 ページ: 2494-2494
  • 査読あり
• [雑誌論文] Integrating DNA replication with Trans-Lesion Synthesis via Cdc7. (2010)
  • 著者名/発表者名: Vaziri, C., Masai H.
  • 雑誌名: Cell Cycle 巻: 9 ページ: 4818-4823
  • 査読あり
• [雑誌論文] ASK. (2010)
  • 著者名/発表者名: Toh G-T., Masai, H.
  • 雑誌名: UCSD-Nature Molecule Pages(Review) 巻: (Published online: 25 Feb 2009)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Eukaryotic DNA replication ; where, when and how? (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Matsumoto, S., You, Z., Sugata-Yoshizawa, N., Oda, M.
  • 雑誌名: Annual.Rev.Biochem. 巻: 79 ページ: 89-130
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stalled replication forks : Making ends meet for recognition and stabilization. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Tanaka, T., Kohda, D.
  • 雑誌名: BioEssays 巻: 32 ページ: 687-697
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacterial primosome. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Masai, H.
  • 雑誌名: Encyclopedia of Life Sciences
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacterial replication fork. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Masai, H.
  • 雑誌名: Encyclopedia of Life Sciences
  • 査読あり
• [雑誌論文] Eukaryotic DNA replication ; where, when and how? (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Matsumoto, S., You, Z., Sugata-Yoshizawa, N., Oda, M.
  • 雑誌名: Annual.Rev.Biochem. (In press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selection of replication origins in fission yeast (2010)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, S., Hayano, M., Kanoh, Y., Masai, H.
  • 雑誌名: Chromosoma (To be published)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cdc7L1 (2010)
  • 著者名/発表者名: Toh G-T., Masai, H.
  • 雑誌名: UCSD-Nature Molecule Pages (In press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stalled replication forks : Making ends meet for recognition and stabilization (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Tanaka, T., Kohda, D.
  • 雑誌名: BioEssays (In press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacterial primosome (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Masai, H.
  • 雑誌名: Encyclopedia of Life Sciences (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacterial replication fork (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Masai, H.
  • 雑誌名: Encyclopedia of Life Sciences (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interactions between Swil-Swi3, Mrc1 and S phase kinase, Hsk1 may regulate cellular responses to stalled replication forks in fission yeast (2009)
  • 著者名/発表者名: Shimmoto, S., Matsumoto, S., Hayano, M., Yokoyama, M., Noguchi, E., Russell, P., Masai, H.
  • 雑誌名: Genes to Cells 14 ページ: 669-682
  • 査読あり
• [雑誌論文] Replisome progression complex links DNA replication to sister chromatid cohesion in Xenopus egg extracts (2009)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, H., Kubota, Y., Tsujimura, T., Kumano, M., Masai, H., Takisawa, H.
  • 雑誌名: Genes to Cells 14 ページ: 949-963
  • 査読あり
• [雑誌論文] Roles of human AND-1 in chromosome transactions in S phase (2009)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa-Sugata, N., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 284 ページ: 20718-20728
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deregulated Cdc6 inhibits DNA replication and suppresses Cdc7-mediated phosphorylation of Mcm2-7 complex (2009)
  • 著者名/発表者名: Kundu, L.R., Kumata, Y, Kakusho, N., Watanabe, S., Furukohri, A., Waga, S., Sekia, M., Masai, H., Enomoto, T., Tada, S.
  • 雑誌名: Nucleic Acid Res. (In press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Casein Kinase 2-dependent phosphorylation of human Rad9 mediates the interaction between human Rad9-Hus1-Rad1 complex and TopBP1 (2009)
  • 著者名/発表者名: Takeishi, Y., Ohashi, E., Ogawa, K., Masai, H., Obuse, C., Tsurimoto, T.
  • 雑誌名: Genes to Cells (In press)
  • NAID: 120005227474
  • 査読あり
• [雑誌論文] Drug Design with Cdc7 kinase, a potential novel cancer therapy target (2009)
  • 著者名/発表者名: Sawa, M., Masai, H.
  • 雑誌名: Drug Design, Development and Therapy 2 ページ: 255-264
  • 査読あり
• [雑誌論文] ASK (2009)
  • 著者名/発表者名: Toh, G.K., Masai, H.
  • 雑誌名: UCSD-Nature Molecule Pages (On line)
  • 査読あり
• [学会発表] Toward understanding the regulation of chromosome cycle by Cdc7 kinase. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.(Organizer and speaker)
  • 学会等名: The final symposium on Chromosome Cycle
  • 発表場所: Hongo, Tokyo, Japan(招待講演)
  • 年月日: 2010-10-01
• [学会発表] Regulation of replication program and maintenance of genetic integrity. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Yamazaki, S., Hayano, M., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Kakusho, N., Ishii, A., Shimmoto, M., Oda, M., Yoshizawa, N., Ito, S., Kudo, S.(Organizer and speaker)
  • 学会等名: BMB2010 Symposium
  • 発表場所: Kobe, Japan(招待講演)
• [学会発表] Cell Cycle and Mitosis. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.
  • 学会等名: Karolinska Institute RIKEN Joint Course 'Functional architecture of the cell nucleus
  • 発表場所: RIKEN Yokohama(招待講演)(Invited lecture)
• [学会発表] Cell cycle regulation of embryonic stem cells regulating the maintenance of pluripotency and differentiation. (2010)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Fujii, H., Kanoh, Y., Kakusho, N., Ito, S., Sawano, A., Miyawaki, A.
  • 学会等名: The 53^<rd> annual meeting of the Japan Radiation Society.(日本放射線影響学会)
  • 発表場所: Kyoto, Japan(招待講演)
• [学会発表] 未分化胚性幹細胞の自己増幅と分化誘導を制御する細胞周期制御機構 (2010)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄、藤井裕子、加納豊、伊藤さゆり、沢野朝子、宮脇敦史
  • 学会等名: 第9回日本再生医療学会総会
  • 発表場所: 広島
• [学会発表] 複製開始部位の選択と活性化タイミングの遺伝的制御と可塑性 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 学会等名: 日本遺伝学会第81回大会シンポジウム「日本のDNA複製研究の過去、現在、未来」
  • 発表場所: 信州大学理学部(長野県松本市)
• [学会発表] Actions of Mcm helicase and fork stabilizing factors at replication forks (2009)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., You, Z., Tanaka, T., Yokoyama, M.
  • 学会等名: 第82回日本生化学会大会
  • 発表場所: 神戸
• [学会発表] Cellular responses to stalled replication forks : roles of Cdc7 kinase and fork stabilization factors (2009)
  • 著者名/発表者名: Masai, H.
  • 学会等名: 25th RBC International Symposium "Genomic Instability : mechanisms and diseases"
  • 発表場所: Kyoto
• [学会発表] EBNA1-dependentassociation of mammalian pre-RC components with oriP of Epstein-Barr Virus in vitro (2009)
  • 著者名/発表者名: 森山賢治, 高井裕子, 正井久雄
  • 学会等名: 第32回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] Factors Regulating the Origin Selection in Eukaryotic DNA Replication (2009)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., Matsumoto, S., Hayano, M., Kanoh, Y., Yamazaki, S., Shimmoto, M., Kakusho, N., Kudo, S.
  • 学会等名: 第32回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
• [図書] 細胞周期の時空間的解析(細胞周期フロンティア)(佐方功幸、稲垣昌樹、岸本健雄編集) (2010)
  • 著者名/発表者名: 阪上-沢野朝子、正井久雄、宮脇敦史
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 共立出版
• [図書] なぜ親子は似るの?(なぜなぜ生物学)(MBSJ日本分子生物学会編) (2010)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 15
  • 出版者: 東京化学同人
• [図書] 生物学辞典 (分担) (2010)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 出版者: 東京化学同人
• [図書] 序蛋白質核酸酵素増刊号「染色体サイクル」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 1
  • 出版者: 共立出版
• [図書] 序論 染色体サイクルの基礎. 蛋白質核酸酵素 増刊号「染色体サイクル」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 共立出版
• [図書] 染色体サイクルの連係的制御機構 概論 蛋白質核酸酵素 増刊号「染色体サイクル」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 共立出版
• [図書] Cdc7キナーゼによる染色体サイクル制御. 蛋白質核酸酵素 増刊号「染色体サイクル」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 共立出版
• [図書] S期開始, 進行の制御と疾患. 炎症と免疫 (2009)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 先端医学社
• [図書] 細胞周期を時空間的に可視化する技術. 細胞工学、「細胞周期研究の新たなステージ」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 阪上-沢野朝子、正井久雄、宮脇敦史
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 秀潤社
• [図書] 細胞周期を時空間的に可視化する技術. 最新医学 増刊号 「幹細胞研究の最近の進歩」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 阪上-沢里朝子、正井久雄、宮脇敦史
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 最新医学社
• [備考]
  • URL: http://www.rinshoken.or.jp/CB/index-jp.htm